Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
РИС.100. Стереоизображение участка активного центра пенициллопепсина, связанного с тетрапептидом AlaLysPhe(N0g)А1а (выделено жирной линией) [3129]
комплекса, восстановленного по расщепляемой связи гептапептида -D-HlsProPheHlsPheCHgNHPheValTyrOH с ризопуспепсином [30763, а также близкого по структуре пептида (Н256) - ProThrGluPheCHgNHPheArgGluOH с эндотиапеп-сином [26123. Эти ингибиторы встраиваются в активный центр в вытянутой конформации (рис. 100) так, что атом углерода, имитирующей карбонильную грушу субстрата располагается вблизи каталитически активных остатков Asp32 и Asp215 (нумерация пепсина). Группа NH остатка Phe в положении находится ° яр
на расстоянии 2,83 А от О -атома Asp215 [3076]. Ориентация карбоксильной группы расщепляемой связи может быть выведена из анализа структуры комплексов аспартатных протеаз с пепстатином и его аналогами [3071,3072,3075 3, пептидами типа R-CIKOHJCHgCOR' (где R и R* - остатки аминокислот) [3073,
Рис.101. Расстояния между атомами кислорода карбоксильных групп активных центров аспартатных протеаз (нумерация ри-зопуспепсина) и молекулой воды
Цифры (сверху вниз) для ендотиапепсина, пенициллопепсина и ризопуспепсина [3076]
31303 и из модельных построений [2334,31313- В свободных ферментах группы Asp32 и Asp215 образуют удивительно симметричную структуру (рис.101). Карбонильная группа субстрата распологается, по-видимому, так, что молекула воды, связанная с четырьмя атомами кислорода Asp32 и Asp215, вытесняется карбонильным атомом кислорода субстрата [31313- Боковая цепь остатка р
WAT507
взаимодействует с группой гидрофобных остатков в ферменте - ИеЗО, Туг75, Phe111 и 11е120. Группа NH этого остатка образует Н-связь с карбонильной группой Gly217. Как уже отмечалось в гл.4, аспартатные протеазы можно разделить на две группы по специфичности к Р -остатку - группу пепсина, куда входят пепсины из разных источников, химозин, ренин и др., специфичные к ароматическим и объемным гидрофобным остаткам в этом положении, и группу пенициллопепсина (эндотиапепсин, ризопуспепсин и др.), обладающую выраженной лизиновой специфичностью [2334-3.
Важное отличие этих двух групп ферментов - остаток Азр114, характерный для всех изученных ферментов, способных гидролизовать субстраты, содержащие в Р1 остаток лизина. e-NH2-группа лизина таких субстратов располагается вблизи остатка Aspi14 и взаимодействует с ним, давая, по-влдимоыу, Н-связь через мостиковую молекулу волы [23343- Следует отметить, что пепсин также имеет катионсвязывающий центр, расположенный в области вторичных фермент-субстратных взаимодействий как в S-, так и в S'-областях [30053.
Модельные построения и данные рентгеноструктурного анализа дают зоны вторичных Взаимодействий для "идеального" (по данным индексов специфичности, см. разд.4.3.2.1) субстрата пепсина, приведенные в табл.72 [12703.
Таблица 72. Остатки пепсина, контактирующие с боковыми цепями "идеального" субстрата HAsnlleGluPheTyrValLeuOH
Субстрат Остатки пепсина
р* Абп Thr12, Бег219, Leu220, (Glu244, Met245)
рч Не Б, Glu13, 11еЗО, Phem, Phel17, Бег219
р? Glu Б? Thr218, Th:?222, Glu287, Met289, Gly?6, Thr77
Р1 Phe Б1 Ile30, Авр32, Tyr75, Thr77, Phe111, Leu112,
Phe117, Ile120,Gly217
р; Туг в; 'хуг189, (Gln'i 91 ), Ile213, Val291 , Thr293,
Leu298, Ile300
р? Val б? Gly34, Бег35, Абп37, Ile73, Туг75, А1а130
рз Leu Бз Ile128, Glyl 88, Tyr189
Группы NH и СО субстрата в положениях Рг, Р^, и PJ, образуют водородные связи с соответствующими патрнерами основной цепи фермента и карбоксильными группами остатков аспаргиновой кислоты. N-концевой фрагмент пептидного субстрата, по-видимому, более подвижен в комплексе, чем С-концевой фрагмент, о чем свидетельствуют ЭПР-спектры соответственно меченных спин-метками аналогов пепстатина [3132 3. Что касается конформационных перестроек самих ферментов при спгзгвании субстратоподобных ингибиторов, то этот процесс не сопровождается значительными изменениями в области активных центров. Однако, как это было отмечено, для пепсина И2703 и для эндотиапепсина [30733 происходит хотя и небольшое, но важное изменение взаимного расположения двух доменов - N- и С-концевых. С-концевой домен (остатки 193-298) поворачивается целиком (как "твердое тело") на ~4° и смещается на 0,3 А вдоль оси, проходящей через Са-атомы остатков Asp32 и Asp215. Это приводит к заметному изменению конфигурации всей "щели" активного центра - расстояние
о
между некоторыми остатками изменяется на величину до 2 А. Предполагается С30733, что эти изменения важны для механизма действия (см. гл.7). Боковые
о
цепи некоторых остатков смещаются на расстояние до 2,5-3,Б А.
На основе вышеприведенных экспериментальных данных была построена модель комплексов аспартатных протеаз с субстратом в переходном состоянии (или,
