Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Антонов В.К. -> "Химия протеолиза " -> 161

Химия протеолиза - Антонов В.К.

Антонов В.К. Химия протеолиза — М.: Наука, 1991. — 504 c.
Скачать (прямая ссылка): himiyaprotezana1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 155 156 157 158 159 160 < 161 > 162 163 164 165 166 167 .. 278 >> Следующая

Проблема резонансной дестабилизации амидной группы в свободных пептидах и фермент-субстратных комплексах уже обсувдалась выше (разд.1.2.1, 3.3.1 и
6.5.2). Следует еще раз подчеркнуть, что степень пирамлализации зависит от расстояния между нуклеофилом и карбонильным углеродом амида [1469,3197] и, по-видимому, может существенно стабилизироваться вторичными взаимодействиями фермента и субстрата.
Рис.107. Изменение гибридизации в амидной группе цри вращении вокруг связи C-N [3136]
Таким образом, можно обоснованно полагать, что в комплексах ферментов с истинными субстратами может происходить заметное нарушение копланарности амидной связи и, следовательно, снижение энергии ее резонансной стабилизации.
"Скручивание" амидной группч должно приводить к изменению гибридизации карбонильного С-атома и атома азота [3136] (рис.107), что делает неравноценными направления присоединения нуклеофила или протона.
7.4. Ковалентный или общий основной катализ?
Каталитически активная- нуклеофильная группа фермента может выступать в качестве ковалентного катализатора, непосредственно атакуя карбонильный атом углерода субстрата:
R R R
г А=о E-x-i-сг------------------• е—X—i=
Ahr' Jmr* j
E-X“ C=0 Е-Х-С-СГ-----------------. E-X-C=0 + NH2R' (1 )
И т.д.
или же в качестве общего основного катализатора, способствуя отщеплению протона от молекулы воды:
R R
(U E-XH-HO-i
i NHR'
Е-Х“ Н-0 С=0 Е-ХН-НО-С-СГ------- Е-Х- • R-COOH + NH2R'. (2)
NHR’
и т.д.
В первом случае образующийся после распада промежуточного тетраэдрического соединения ацильный фрагмент субстрата остается связанным ковалентно с ферментом, тогда как во втором случае такая ковалентная связь отсутствует. Промежуточный ацилфермент в зависимости от соотношения скоростей его образования и распада может накапливаться или не накапливаться в ходе реакции.
Если ацилфермент накапливается в системе, то установить ковалентный тип катализа достаточно просто. Наиболее общий прием заключается в измерении каталитических констант для серии субстратов с одинаковой ацильной частью и разными уходящими группами. Действительно, в этом случае (см. разд.4.1.1) реакция идет по трехстадийной схеме:
кз
Е + S *=—= ES ----------- ЕА ------> Е + Р2,
+
Р1
где ЕА - ацилфермент; &cat=ft2&3/&2+&3 и при &г»&3 &cat=&3. Для всего ряда субстратов величгна &cat должна быть одинакивой [1666,1721]. Как видно из
Таблица 74п Кинетические константы катализируемого химотрипсином гидролиза производных ациламинокислот [1761 ]
Субстрат* k с-1 fc,, c~1 CJ
cat О
1
АсТгрОМе 27,7±0,5 730 29
AcTrpOEt 26,9±0,5 700 28
AcTrpONp 30,5±1 ,2 38 300 30,5
AcTrpNH2 0,026 0,026 30
AcPheOMe 57,5 280 72
AcPheOEt 63,5 530 72
AcPheONp 77,0 23 700 77
AcPheNH2 0,039 0,039 72
*ONp - n-нитрофениловый эфир.
данных, приведенных в таОл.74, указанное постоянство значений ft действительно имеет место для рядя эфиров ациламинокислот - субстратов химотрипсина.
Для различных амидов ациламинокислот величины ftcat сильно различаются, что обусловлено несоблюдением неравенства ft?»ft3.
Этот метод был использован для большого числа сериновых и некоторых цистеиновых протеаз [1766,3198,31993. Следует отметить, что эти исследования не всегда позволяют выявить характер лимитирующей скорость стадии [1427].
Иногда удается детектировать промежуточный ацилфермент с помощью спектральных методов в условиях, когда скорость его распада понижена, например в кислой среде [3200-3205] или в условиях криоэнзимологического эксперимента [2512,3206-3208] (см. также разд.5.7). Однако в этом случае не всегда удается надежным образом отличить ковалентное промежуточное соединение от прочного комплекса фермент-продукт. Були предложены [3205,3209] модификации спектральных методов, существенно повышающие их точность, в том числе и методы флуоресцентного анализа, использованные для идентификации ацилфермента при катализе (3-лактамазой I [3210,3211].
Успешно применяется так называемый метод перехвата, т.е. образования из ацилфермента нового производного субстрата путем переноса ацильного фрагмента на нуклеофильный акцептор:
E-X-C0R + HYR1 ------> Е-ХН + R1YC0R.
Эти реакции можно изучать кинетически, измеряя отношение fccat/Km Для гидролиза субстрата в присутствии нуклеофильного акцептора. В случае если перенос имеет место, то константа скорости второго порядка зависит от концентрации акцептора:
ftg[H20]
Кв -> Е + RC00H + R1XH
Предыдущая << 1 .. 155 156 157 158 159 160 < 161 > 162 163 164 165 166 167 .. 278 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed