Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Рис.102. Структура тетраэдрического промежуточного соединения в активном центре аспартатных протеаз
ОН и ОТ - атомы кислорода расщепляемой группы субстрата Пунктирные линии - водородные связи. Показано взаимодействие одного из атомов кислорода (ОТ) с ароматическим циклом Тут75 [3130]
скорее, в виде тетраэдрического промежуточного соединения) [31303 (рис. 102). Обращает на себя внимание постулированное в этом комплексе-взаимодействие одного из атомов кислорода тетраэдра с ароматическим циклом остатка ТугТ5, которое может давать вклад в энергию связывания до Б ккал/моль [31333.
Ыеталлозависимые протеазы. Известна структура комплексов карбоксипептидазы А с рядом субстратоподобных ингибиторов и структура фермент-ингибитор-ных комплексов термолизина (см. табл.69). Наиболее подробно был изучен комплекс карбоксипептидазы А с GlyTyr. Предполагалось, что связывание этого дипептида ферментом отражает продуктивное связывание истинного субстрата, однако дальнейшие исследования [30793 показали, что субстрат вытесняет воду из координационной сферы иона Zn2+, т.е. связывается непродуктивно. Вместе с тем исследование этого комплекса дало очень много для понимания структуры и механизма действия карбоксипептидазы А.
Глицилтирозин связывается ферментом вблизи атома цинка так, что ароматическая боковая цепь лиганда помещается в "гидрофобный карман", образованный боковыми цепями остатков Ile243, Ile247, Tyr248, Gly253, 11е255, Т11Г268.
Боковая цепь остатка Туг248 располагается в плоскости почти перпендикулярной плоскости тирозинового кольца субстрата (рис.103).
Карбоксилат-ион субстрата образует солевую связь с гуанидиногруппой остатка Arg145, а карбонильная группа амидной связи координирует с ионом Zn2+. В истинных субстратах эта группа, по-видимому, направлена в сторону гуанидиногруппы остатка Arg127 [30811. Заряженная аминогруппа при высоких значениях pH (в непротонированной форме) дает координационную связь с ионом Zn2+ [31343, что приводит к вытеснению воды.
Все эти взаимодействия сопровождаются значительными конформационными пе-,-Эстройками в активном центре фермента: а) гуанидиновая группа Arg145 пере-
О
шагается на 2 А в направлении к лиганду за счет поворота вокруг связи Ср-
РИС.103. Стереоизображение псевдосубстрата глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А [ 149]
о
С ; б) карбоксильная группа Glu27Q также смещается на 2 А и занимает поло-
7 о
жение, в котором один из атомов кислорода отстоит на 3,6 А от карбонильного углерода субстрата; 6) наиболее значительным является изменение ориентации
О
боковой цегш Туг248. Фенольный гидроксил этого остатка перемещается на 12 А
о
за счет вращения вокруг С -Св-связи и небольшого (1-2 А) смещения полипеп-
ар о
тидной цепи. В новом положении фенольный гидроксил Туг248 отстоит на 3 А от NH-группы расщепляемой связи. Перемещение Туг248 становится возможным в результате смещения Arg145 при образовании этим остатком солевой связи с карбоксилат-ионом субстрата.
Квантово-химические расчеты [31353 показывают, что энергетически более выгодным является механизм "скольжения" субстрата в направлении Arg145, так что карбогошшт-ион попеременно образует солевые связи с остатками Arg7l, Arg127 и, наконец, Arg145.
На основании анализа моделей было сделано заключение, что при связывании субстрата в активном центре карбоксипептидазы А возМ' >жно существенное искажение плоской структуры амидной связи. Этому обстоятельству придается большое значение при формулировании механизма действия фермента [3136,3137 3.
Моделирование структуры комплекса карбоксипепгщгзы А с пептидом ZAlaAlaTyr [31381, а также анализ структуры комплекса фермента с белковым ингибитором из картофеля [3082 3 позволили идентифицировать вторичные участки связывания в области остатков Arg7l, Туг248 и Phe279.
Изложенные выше результаты вызвали острую дискуссию (см.: [1964, гл.1;
31393), особенно в отношении данных по перемещению остатка Туг248. Было показано [1370,31403, что в карбоксипептидазе А, модифицированной арсаниловой кислотой по Туг248, связывание субстрата (в растворе) приводит к переходу метки во внешние слои белковой молекулы, доступные растворителю. Отсюда ставилась под сомнение роль этого остатка в катализе. В конечном счете выяснилось, что этот остаток можно методом направленного мутагенеза (см. разд.4.6.2.) заменить на остаток фенилаланина без заметного изменения активности. По-видимому, спектральные изменения, наблюдавшиеся для арсанил-производных фермента, обусловлены особенностями его кристаллической упаковки [1371,30353. Вместе с тем Туг248 все же участвует в стабилизации комплекса, образуя водородные связи с карбоксильной группой С-концевого остатка субстрата и NH-группой остатка Р .
