Химия протеолиза - Антонов В.К.
Скачать (прямая ссылка):
Обширная дискуссия происходила в отношении числа связывающих субстрат центров у карбоксипептидазы А. Это было вызвано различными спектральными свойствами комплексов фермента с эфирами и амидами [31413. Однако большин-
а
Y248
1
Y248
О
II
.с
JS....Arg*
НС—СС0_--"145
JS-.
Г*______
Glu V
ОН
72
РИС.104. Стереоизображение (а) ингибитора - 2-бензил-4-оксо-5,5,5-триф'гОрдентановой кислоты, моделирующей тетраедричес-кое промежуточное соединение, и схема расположения истинного тетраэдрического промежуточного соединения в активном центре
карбоксипептидазы А (<3) [3078]
ство исследователей разделяют представление о том, что различия в поведении эфиров и амидов обусловлены тем, что карбонил этих субстратов связан соответственно или с ионом Zn2+ или с гуанидиногруппой остатка Arg127. Важное значение может иметь также различие в скорость лимитирующей стадии процесса гидролиза [3077,3142].
Исследование кетоаналогов субстратов [3078,3080], а также фосфонамидатов [2628,3081] в комплексах с карбоксипептидазой позволили составить представление о структуре промежуточных тетраэдрических соединений в ходе катализа. Оба атома кислорода тетраэдра входят в координационную сферу иона Zn2+, а также связываются с остатками Glu2ri0 и Arg127. Схема структуры тетраэдрического промежуточного соединения показана на рис.104.
Несмотря на существенные различия в структуре карбоксипептидазы А и термолизина, ориентация субстратоподобных ингибиторов в активных центрах этих двух ферментов имеет много общего. Изучение структуры комплексов термолизина с р-фенилпропионил-1-фенилаланином, бензилоксикарбонил-Ь-фенилаланином, I-бензилянтарной кислотой, фосфоамидоном и другими лигандами [2628,2728, 2891,3083-3087] позволило следующим образом представить строение продуктивного комплекса этого фермента с субстратом (рис.105). Ароматическая боковая цепь остатка Р’ субстрата связываемся в гчдрофэбном кармане фермента, образованном остатками Val139, Leu133, Phe130, Leu202, Gly189, Val192 и Ile188. Карбоксильная группа Pj-остатка образует водородную связь с гуанидиногруппой Arg203, a NH- и СО-группы остатка PZ, субстр&та - водородные связи с амидной группой боковой цепи остатка Asp112. Остаток Р? связывается с основной цепью остатка Тгр115, образуя с ним участок р-структуры. Расщепляемая связь субстрата локализуется вблизи иона Zn2+ и его карбонильная группа занимает положение четвертого лиганда атома металла. Карбоксильная группа
о
Glu143 оказывается на расстоянии около 4 А от карбонильного атома углерода, причем рядом с карбоксилом расположена молекула воды. Наконец, Ne2-aT0M остатка His231 оказывается вблизи NH-группы Pj-остатка субстрата. Конформационные изменения, детектируемые при связывании фосфоамидона, ограничиваются
о
несколькими десятыми долями А и затрагивают боковые цепи остатков Asn112,
Рис.105. Связывание субстрата в активном центре термолизина [3085]
Leu202 и Glu143.
Непосредственное окружение иона Zn2+ в термолизине и карбоксипептидазе А очень сходно [1348,2628]. Более того, такое же окружение наблюдается у некоторых дегидрогеназ.
Важным обстоятельством является то, что в ближайшее окружение атома металла входят как карбонильная группа субстрата, тчк и молекула воды, т.е. цинк находится, по-видимому, в пентакоординациснном состоянии.
6.6. Оценка полной энергии фермент-субстратного каимодействия
Интересно -оценить полную энергию взаимодействий субстрата и фермента и сравнить ее с наблюдаемыми вьличшхми. Дать такую оценку можно лишь весьма приближенно. Из данных по структуре комплекса AcProAlaProTyrOH в активном центре протеазы А из Streptomyces grlseus известно [3063], что этот тетра-
о
пептид образует с ферментом 78 Вангдер-ваальсовых контактов с г<4 А и 1 водородных связей. Причитая среднюю величину энергии Ван-дер-ваальсова контакта в -0,05 ккал/моль и энергию водородной связи порядка -3 ккал/моль (см.табл.66), получее» полную энергию взаимодействия порядка -25 ккал/моль. Оценки энергии взаимодействия Р1-остатка в карбоксипептидазе А [3143] дали значение -1Б ккал/моль. Полная энергия невалентных взаимодействий в ацил-ферменте - индолилакрилоилхимотрипсине [3021] составляет около -30 ккал на моль. Электростатическое взаимодействие карбоксилат-иона и гуанидиногрупш в карбоксипептидазе дает вклад около -11 ккал/моль [3135]. Наконец, Ван-дер-ваальсовы взаимодействия в подцентре D активного центра лизовдма с гли-копиранозидным циклом составляют -14 ккал/моль [2939].
Для всех перечисленных соединений константы равновесия комплексообразо-вания составляют около 1.10-3—1•1СГД М, что соответствует изменению свободной энергии 4,2-5,5 ккал/моль. Величина энтальпии комплексообразования, например ацетилтриптофана с химотрипсином, составляет -9 ккал/моль [2469]. Таким образом, наблюдаемая энергия комплексообразования, по-видимому, намного ниже, чем та энергия, которая получается расчетным путем при суммировании всех взаимодействий белка и лиганда.
