Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
По этим результатам можно видеть, что даже такая легкая сшивка делает белок значительно устойчивее, по крайней мере к действию ферментов. В то же время, такие количества модификатора практически не могут способствовать межмолеку-лярному взаимодействию и приводить к взаимному разрушению молекул. Во всех синтезах для консервации и упрочнения белковых глобул смешиванию с силикагелем предшествовало добавление к белковому раствору указанных микроколичеств глутарового альдегида и перемешивание в течение 1 ч [98, 99].
Закономерен вопрос о способе фиксации полученной сшивки. Во-первых, необходимо устранить непрореагировавшие альдегидные группы для предотвращения возможного химического взаимодействия покрытия частиц с компонентами пробы и друг с другом. Для этой цели можно использовать различные агенты, содержащие аминогруппы, или восстановители, например ТРИС, лизин, сульфат аммония, бисульфит или борогидрид натрия. Кинетика реакции и стабильность образующихся продуктов описаны в работе [100]. Во-вторых, некоторые образующиеся альдиминные связи неустойчивы в различных средах, поэтому также нуждаются в восстановлении. Таким образом, в качестве терминатора реакции используется борогидрид натрия. Восстановление непрореагировавших альдегидных групп и образовавшихся связей происходит быстро (20-30 мин. при 6°С) и количественно при соотношении [реагент] / [СНО-группы] = 0,5 моль/моль. Временное восстановление и, возможно, частичное перераспределение дисульфидных связей уже после сорбции и межмолекулярной сшивки глутаровым альдегидом не должно существенно нарушить глобулярную структуру белкового покрытия [11-13, 98, 99].
9.9]
Сорбенты с иммобилизованными белками
551
Актуальность дополнительной обработки для стабильной работы колонки становится очевидной из результатов исследований воспроизводимости хроматографического разделения при длительном использовании колонок в экстремальных для белка условиях. Так, например, в работе [55] указано, что при длительной (несколько недель) экспозиции колонок с сорбентами Separon НЕМА 1000-BSA и Separon НЕМА lOOO-BIO-BSA при pH = 10 времена удерживания уменьшаются для монокарбоновых и аминокислот и увеличиваются для дикарбоновых, причем скорость этих изменений возрастает при введении в элюент пропанола или капри-ловой кислоты (до 3%) в качестве органических добавок. Очевидно, здесь имеет место частичная денатурация иммобилизованного белка, в результате которой изменяются некоторые стерические факторы, критически влияющие на механизм удерживания.
Авторы [56], напротив, рекомендуют для улучшения разрешения и энантио-селективности сорбентов с ковалентно иммобилизованным БСА при разделении N-бензоилпроизводных В,Ь-изомеров аланина и фенилаланина проводить предварительную обработку, заключающуюся в промывании колонок поочередно водой и неполярными растворителями (до 9 циклов) и завершающей промывкой 4 М раствором мочевины. В работе [57], сравнивая энантиоселективность при разделении бензоил- и дансилпроизводных аминокислот ряда сорбентов с ковалентно иммобилизованными на 4-аминопропилсиликагеле Vydac ТР 101 (10 мкм) БСА, гликопротеином, овальбумином, миоглобином и лактодегидрогеназой с последующей поперечной сшивкой глутаровым альдегидом с коммерческими белоксодержащими сорбентами Resolvosil BSA и Enantiopac AGP, авторы также указывают на общее улучшение разделения после предварительной промывки органическими растворителями (такими, как метанол, ТГФ или ацетонитрил), отмечая, что лучшую селективность имеют коммерческие сорбенты. Здесь важно подчеркнуть, что при изготовлении всех сорбентов авторы применяли фиксирующую поперечную сшивку.
Перейдем к иммобилизации белков в более общем виде. Хорошо известно, что белки плазмы крови, по крайней мере млекопитающих, практически мгновенно адсорбируются из раствора на любой границе раздела фаз, в том числе на внесенной в их раствор инородной твердой поверхности. Это существенно затрудняет, например, имплантацию искусственных органов в медицинской практике. Как показывают результаты исследований [101], адсорбирующая активность полиуретана, применяемого в хирургии, в значительной степени зависит от параметров поверхности на молекулярном уровне, что требует очень тонкой регулировки соотношений при добавке сополимеров (мочевины) и других условий синтеза. Иначе уже при незначительном отклонении от этих условий полиуретановые матрицы становятся удобны для использования в качестве подложки для выращивания, например, бактериальных культур, т. е. имеют высокое сродство к белкам.
В. Н. Измайлова и П. А. Ребиндер [92, с. 70 и далее] изучали адсорбцию БСА на различных границах раздела и установили, что, если адсорбция на гидрофобных поверхностях удовлетворяет «критериальному фильтру» и хорошо описывается изотермой Лэнгмюра (что свидетельствует о преобладании взаимодействий белок-поверхность над межмолекулярными), то в случае с гидрофильной поверхностью последние уже вносят заметный вклад в процесс сорбции. Однако даже при адсорбции БСА на чистом силикагеле из 0,04 мМ натрий-фосфатного раствора при pH = 5,0 достигается значение адсорбции 4,8 • 10-7 моль/м2, что соответствует степени заполнения 9 > 1 (п (число монослоев) « 10—15, о способе расчета
