Химия привитых поверхностных соединений - Лисичкин Г.В.
ISBN 5-9221-0342-3
Скачать (прямая ссылка):
Вероятно, основную роль в поддержании нативной конформации белковой макромолекулы играют дисульфидные связи между цистеиновыми остатками в по-липептидной цепи. Так, например, молекула сывороточного альбумина содержит 17 S—S-связей и 0,5-0,7 SH-групп. Эта дробная величина связана, вероятно, с существованием в растворе белка димеров с образованием S—S-связи. С разрушением сульфидных мостиков связывают процесс необратимой денатурации белка: при сдвиге pH ниже критического значения (сульфогидрильные SH-группы стабильны только в кислых средах), при воздействии восстановителей, при длительном действии денатурирующих агентов или при сочетании этих факторов происходит необратимая денатурация вследствие обмена дисульфидными связями между цистеиновыми остатками одной молекулы по схеме
RS—SR' + R"S—SR'" = RS---SR'" + R"S—SR',
что приводит к образованию и фиксации иной конформационной структуры (например, при химической завивке волос).
Молекулу сывороточного альбумина удобнее всего аппроксимировать как эллипсоид вращения и для выражения формы и размеров использовать величины осей (далее а и Ь) и их соотношения а/Ъ. Значения этих величин существенно различаются в зависимости от методов измерения и расчета и коррелируют для одинаковых условий измерения (температура, pH, концентрация и ионная сила раствора). Приняв эллипсоид вращения в качестве модели молекулы бычьего сывороточного альбумина, по данным, приведенным в [93, с. 71-73], было установлено, что в изоэлектрической точке при нулевой ионной силе молекула характеризуется отношением осей а/Ъ, равным 3, а при ионной силе 0,05 молекула становится сферой. При любой ионной силе молекула удлиняется, если pH смещается от изоэлектрической точки. Например в 0,15 М NaCl при значениях pH = 3,45; 3,95; 6,30 и 7,40 соотношение осей а/Ъ составляет соответственно 5,8; 3,3; 2,6 и 3,3 (рис. 9.11).
Это изменение конфигурации бычьего сывороточного альбумина в кислом растворе является очень быстрой реакцией с полупериодом менее 1 сек.
548 Гетероповерхпостные сорбенты и их применение [ Гл. 9
Важно отметить, что при измерениях параметров белковой молекулы различными способами, основанными на измерениях поступательной диффузии, характеристической вязкости, двойного лучепреломления в потоке и электрическом поле, электрофоретической подвижности, светорассеяния, осмотического давления, рентгеноструктурного анализа влажных и сухих кристаллов и др., значения молекулярных масс не дают такого существенного расхождения (для бычьего сывороточного альбумина: 66000 -г- 83000), как получаемые значения для отношения осей (а/Ь — 1 -j- 4 в нейтральных растворах и в кристаллах). Столь большие расхождения неудивительны, поскольку вычисления основаны на предположении, что молекулы белка являются эллипсоидами вращения. Наиболее надежно соотношения осей характеризуют величины, найденные для очень крупных белковых молекул методами электронной микроскопии непосредственно.
Определение истинной формы молекул весьма сложно, и при поиске простых моделей следует учитывать их приближенность. Например, из данных по седиментации следует, что эффективный радиус эквивалентной сферы увеличивается с 3,5 до 5,5 нм при изменении pH от 4,23 до 2,29. Одновременно суммарный заряд молекулы альбумина увеличивается с 12 до 74. Очевидно, что эффективный радиус заряженной макромолекулы при седиментации существенно превышает ее геометрический размер из-за взаимного отталкивания одноименно заряженных частиц. Отталкивание одноименно заряженных фрагментов в одной макромолекуле, безусловно, должно приводить к некоторому ее «набуханию». Все это в различной степени относится и к размерам, установленным иными методами, так что под размерами белковой макромолекулы всегда подразумевается некое поле, эффективное для данного метода измерения.
По этим соображениям становится понятной важность точного определения изоэлектрической точки белка, однако, поскольку связывание различного рода ионов (особенно многовалентных и органических) значительно изменяет положение изоэлектрической точки белка, она не является постоянной величиной. Для обозначения pH чистого белка в свободной от солей воде употребляется термин изоионная точка (pi). Прямое определение этой константы трудно, а часто и невозможно, осуществить, так как многие белки в отсутствие солей нерастворимы; кроме того, проводимость обессоленных растворов крайне низка. Обычно изоионную точку определяют косвенно — путем измерения изоэлектрической точки при различных концентрациях нейтральных солей и экстраполяции к нулевой концентрации [38, с. 122]. К сожалению, в различных источниках наблюдается значительный разброс величин pi: для БСА, например, от 4,7 [94, с. 318] до 5,3 [95, с. 55].
Важной характеристикой белка в аспекте его иммобилизации является структура поверхности, которая представляет собой довольно сложную мозаику полярных и неполярных областей. В то время, как у интегральных белков биологических мембран (например, у бактериального родопсина) гидрофобная область составляет 70-80 % поверхности и имеет форму кольца, что обеспечивает совмещение молекулы
