Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
3*
36
Глава 1
сида в эупергите С наряду с макропористой природой матрицы часто приводит к значительной емкости по связыванию белков. Может также достигаться и высокая активность иммобилизованного продукта; приведем активность некоторых иммобилизованных ферментов:
Фермент Активность а, Е/г геля
Пенициллинамидаза (Escherichia coli) 500
Трипсин 600
?-Галактозидаза 500
Рибонуклеаза (поджелудочная железа быка; 90
РНК из дрожжей в качестве субстрата)
Во всех случаях единицы активности определялись по количеству (в мкмолях) субстрата, гидролизованного за 1 мин при 37 °С.
Специальная модификация матрицы или удаление избыточных оксирановых групп не обязательны для большинства ферментов. Однако высокое содержание оксирановых групп имеет важное значение для химической модификации матрицы. От этого фактора зависит, в частности, использование фенилборо-нат-эупергита. Гемоглобин к\с связывается с этой матрицей, причем взаимодействие обеспечивается высокой концентрацией лиганда (CNBr-активация агарозы не обеспечивает такой концентрации лиганда) [Миддл Ф. (Middle F. А.), неопубликованные данные].
Обнаружено, что в некоторых случаях после присоединения белка сохраняется достаточное количество оксирановых групп для дальнейшей модификации матрицы с целью придания ей более анионного, катионного, гидрофильного или гидрофобного характера. Это достигается реакцией с соответствующими низкомолекулярными соединениями (например, сульфгидрильными или аминосоединениями), содержащими желаемые функциональные группы. Так, значительная стабилизация пенициллин-амидазы (Е. coli), иммобилизованной на эупергите С, против щелочной дезактивации может быть достигнута модификацией реагентом Клеланда или другими дисульфгидрильными соединениями.
Однако в случае таких лигандов, как антитела или антигены, следует удалять избыточные оксирановые группы. По этой причине фирмы-производители рекомендуют альтернативные методы иммобилизации. Подробности об этих методах приводятся в специальных руководствах фирмы Rohm Pharma. Один из примеров приводится ниже в разд. 10.2.5.
Получение матриц
37
10.2.5. Методика. Обработка меркаптоэтанолом приводит к блокированию эпоксидных групп при сохранении электронейтральной и гидрофильной природы матрицы. Влажные шарики, содержащие присоединенный белок, промывают на пористом стеклянном фильтре (пористость 2) 0,01 M фосфатным буфером (pH 8,0; 10 объемов). Добавляют 5%-ный (об./об.) водный раствор меркаптоэтанола (pH до 7,6ч-8,0 доводят с помощью NaOH) на 1 г влажных шариков и оставляют на ночь при комнатной температуре. Продукт промывают дистиллированной водой (10 раз пятикратными объемами) и переносят в буфер, в котором его предполагается использовать. Влажные шарики хранят при 4 0C. Для предотвращения микробного ростд добавляют формальдегид.
11. ГРАНУЛИРОВАННЫЙ ПОРИСТЫЙ оксид АЛЮМИНИЯ
Р. К. Барабино, М. Г. Кейс (R. С. Barabino, М. Н. Keyes) 11.1. Введение
Исследования гранулированного пористого оксида алюминия (KIMAL; кимал) в качестве твердого носителя для иммобилизации ферментов начались в 1974 г, главным образом из-за ограничений в скорости потока при применении полисахарид-ных носителей в клиническом приборе Partitioned Enzyme-Sensors. Например, в приборе Owens-Illinois BUN [27] образец, содержащий мочевину, проходит через колонку с иммобилизованной уреазой (3X76 мм) и далее смешивается с потоком, содержащим сильное основание. При этом выделяется аммиак, который и определяется при помощи газового электрода.
Скорость потока в этом приборе приблизительно 1 мл/мин. Если используется полисахаридный носитель, то часто происходит уплотнение сорбента в колонке, что приводит к неустойчивой скорости потока. Считается, что полисахаридные носители не отвечают требованиям колоночного процесса по двум основным причинам: 1) при клинических анализах в автоматическом режиме (>50 анализов/ч) обычно требуются высокие скорости потока, при которых происходит уплотнение поли-сахаридных шариков, и 2) при разрушении полисахаридных шариков они могут образовывать комки, что также ограничивает применяемые скорости потока и уменьшает срок эксплуатации детектора [28].
Таким образом, возникла потребность в поиске пористого неорганического носителя, удовлетворяющего нескольким требованиям. Носитель должен:
38
Глава 1
1) быть физически устойчивым к деформации или разрушению при высоких скоростях тока;
2) обеспечивать связывание белков с высоким выходом и с сохранением активности, достигаемой при использовании многих органических носителей;
3) допускать широкий выбор размеров пор и частиц;
4) характеризоваться стабильностью состава в течение длительного времени.
С целью удовлетворения этих требований был разработан гранулированный пористый оксид алюминия — кимал.
11.2. Получение иммобилизованных смесей (общая методика)
Все реагенты должны быть по крайней мере коммерческой чистоты; они могут быть получены от фирм Aldrich Chemical Company, Fisher Scientific Company или Sigma Chemical Com-рапу.
1) Гранулированный пористый оксид алюминия (кимал) промывают путем декантации деионизованной водой или 0,1 M HCl для удаления мелких частиц и активируют в 6,0 M HCl в течение 1,5—3,0 ч под вакуумом для удаления находящегося в порах воздуха.
