Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
2) Готовят раствор материала для иммобилизации в буфере и хранят его при 4 0C, пока оксид алюминия отмывается от кислоты.
3) Супернатант декантируют, заливают оксид алюминия буфером, суспензию вакуумируют (водоструйный насос) и оставляют (для установления равновесия) на 0,5—1,0 ч.
4) К подготовленному таким образом оксиду алюминия добавляют материал для иммобилизации и оставляют (для адсорбции) на 0,5—1,0 ч.
5) Добавляют раствор бифункционального поперечно-сшивающего агента (за один прием или постепенно в течение 4 ч). Перемешивание можно осуществлять при помощи подвесной мешалки.
6) Реакцию проводят в течение ночи при комнатной температуре.
7) Продукт тщательно промывают водой и затем буфером.
8) Хранят суспензию в буфере при 0ч-5°С.
Количество связанного материала может быть определено термогравиметрическим анализом; результат выражают в процентах (потеря массы после нагревания при 500°С).
11.3. Результаты и обсуждение
В табл. 7 приведены характеристики нескольких носителей, использованных для иммобилизации уреазы. Пористый оксид алюминия, разработанный Owens-Illinois, характеризуется вы
Получение матриц
39
Таблица 7. Характеристики носителей, использованных для иммобилизации
уреазы
Матрица Размер частиц, мкм Активность, ед./г Характеристика выхода элюента с колонки при подаче его со скоростью 0,5 мл/мин Механическая устойчивость Литература
Сефадекс I 30
G-25 J00 Хороший Хорошая
G-200 80 115 Удовлетв. 31
G-200 80 300 30
Сефароза 30
6В 180 500
4В 80 1500 3Q
Стекло
Биогласс 1000 75 15 Хороший » 32
Стекло с контро- 175 20 Плохой » 32
лируемым раз-
мером пор
(GPC 10)
Силикагель
Cab-0-sil (М7) <40 70 32
Полип о р (рої у ро- <100 80 Удовлетв. 31
ге) (8а-437)
Оксид алюминия
Кислотный непо- 150 135 Очень Хорошая 31
ристый 150 13 хороший 31
Нейтральный »
Основный 150 58 » 31
Кимал 325 450 > 31
275 800 Очень 31
160 1500 хорошая
Хороший 31
сокой связывающей емкостью по ферменту, нормальной скоростью потока, очень хорошей механической устойчивостью и хорошей стабильностью состава. Образцы уреазы, иммобилизованной на оксиде алюминия в колонках анализатора Kimble Blood Urea Nitrogen Analyser, как правило, давали воспроизводимые результаты (при 90% конверсии) после анализа 1000 введенных образцов [29].
Исходные активности иммобилизованной на оксиде алюминия уреазы сопоставимы с активностями, достигаемыми при применении полисахаридных носителей, а стабильность полученных неорганических продуктов и измеряемые скорости потока оказались очень хорошими. В результате легко достигается быстрый анализ образцов.
40
Глава 1
При изучении многокомпонентной системы иммобилизованных ферментов для определения а-амилазы в биологических жидкостях [35] было продемонстрировано связывание субстратов с кималом. В этой системе был использован крахмал, присоединенный к активированному кислотой кималу по методике, описанной для ферментов [36]. Количество связавшегося субстрата определяли по адсорбции иода или термогравиметрическим анализом. В табл. 8 приведены данные по количеству субстрата, связанного с оксидом алюминия, для некоторых образцов.
Таблица 8. Примеры субстратов, присоединенных к оксиду алюминия (кимал)
Крахмал Содержание субстрата, мг крахмала/г кимала Литература
Linthner (растворимый) 0,010 33
Амилоза, активированная кислотой 0,П2 31
Амилоза 0,027 34
Амилоза 0,045 34
Амилоза, активированная декстрана- 0,099 31
зой
Амилоза, активированная имидазо- 0,015 31
лом
CNBr-активированная амилоза 0,121 31
ДЭАЭ-декстран 0,500 34
На рис. 11 отражена последовательность движения образца при определении а-амилазы при помощи клинического прибора. При пониженных скоростях потока получены четыре пика. Считают, что эти пики отражают разделение изоферментов на колонке с иммобилизованным субстратом. Единственный пик, полученный при высокой скорости потока (>0,5 мл/мин), был далее разделен на два пика при умеренной скорости потока (>0,2 мл/мин, но <0,5 мл/мин), каждый из которых давал два хорошо разделенных пика при низкой скорости потока (<0,2 мл/мин); таким образом, были получены все четыре пика. Литературные данные, касающиеся выхода с хроматогра-фической колонки а-амилазы, указывают, что смесь компонентов а-амилазы может быть электрофоретически разделена на четыре компонента — два изофермента панкреатического происхождения и два изофермента из слюны [37].
Уникальные свойства кимала, разработанного в лаборатории авторов, позволили использовать оксид алюминия в качестве неорганического носителя не только для иммобилизации ферментов, но и для получения аффинных адсорбентов.
Получение матриц
41
12. СТЕКЛО С КОНТРОЛИРУЕМЫМ РАЗМЕРОМ ПОР
Стекло с контролируемым размером пор — наиболее широко применяемая матрица неорганической природы для иммобилизации биологических молекул. Относительно небольшое число работ посвящено использованию стекла в качестве матрицы для аффинной хроматографии. Известно, что немодифицирован-ное стекло неспецифически адсорбирует ферменты и заметно растворимо при щелочных pH (>8,0). Стекло обладает высокой механической прочностью, термической устойчивостью и, будучи аэрогелем, химически совместимо с большинством органических растворителей.
