Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Спектр поглощения, или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. Такие спектры для красителей в видимой области (400—700 нм) имеют иногда несколько максимумов. Спектры поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм) и видимой областях отражают переходы связанных и несвязанных электронов в молекуле. Это обычно делокализованные я-электроны двойных С=С связей и неподеленные пары азота и кислорода. Поскольку, как правило, электроны в молекуле при комнатной температуре находятся на нижнем энергетическом уровне, спектры в этой области дают информацию об основном и первом возбужденном электронных состояниях молекулы. Ввиду того что длина волны поглощенного света соответствует определенному переходу, пики на спектрах поглощения вещества обусловлены присутствием в нем известных структур. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа >С=0. При образовании сопряженных связей в молекуле энергия возбужденного состояния электронов уменьшается, и, следовательно, хромофор начинает поглощать свет большей длины волны. Такой сдвиг в спектрах поглощения называется батохромным. Наоборот, сдвиг спектра в коротковолновую область именуется гипсохромным. Гиперхром-ный и гипохромный эффекты — это соответственно увеличение и уменьшение экстинкции. Обнаружить очень близко расположенные линии колебательных и вращательных переходов на спектрах молекул удается лишь при высоком разрешении (разрешением называется способность прибора различить две близко расположенные линии).
5.2.1. Оборудование
Для получения спектр.а поглощения необходимо измерить экстинкцию при различных длинах волн. Поглощение в видимой и ультрафиолетовой областях можно регистрировать глазом в первом
Гл. 5. Спектроскопические методы 147
И
Рис. 5.3. Схема устройства простейшего (а) и регистрирующего (б) спектрофотометров.
1 — лампа; 2 — плоское зеркало; 3 — полупрозрачное плоское зеркало; 4 — фокусирующее зеркало; 5 — отражающая призма; 6—кювета с образцом; 7 —кювета сравнения; 8 — фотоэлемент; 9 — регистрация; 10— источник УФ-света; // — источник видимого света; 12 — дифракционная решетка; 13 — зубчатое колесо; 14 — усилитель; 15 — самописец.
случае или фотографированием в обоих случаях. Такие приборы называются соответственно спектроскопами и спектрографами. В спектрофотометре индикатором служит фотоэлемент, ток в котором пропорционален интенсивности падающего на него света. На рис. 5.3,а приведена оптическая схема простого спектрофотометра, работающего в видимой области.
В современных приборах линзы, как правило, заменяют зеркалами. Преимущество зеркал перед линзами заключается в их дешевизне и меньшей потере света из-за хроматической аберрации. В качестве источников света в видимой области применяются лам-6*
148' Часть III. Аналитические методы
пы накаливания, а в ультрафиолетовой — водородные или дейте-риевые лампы.
Монохроматоры. Монохроматор — это оптическая система, выделяющая из всего спектра источника света излучение определенной длины волны. Это обычно призмы, по-разному преломляющие свет разных длин волн, или дифракционные решетки. В видимой области используются обычные стеклянные призмы, но в ультрафиолетовой области1 они не годятся, поскольку стекло начинает поглощать уже при к < 400 нм, поэтому призмы делают из кварца. На самом деле к образцу от монохроматора поступает не монохроматическое излучение, а свет в некотором диапазоне длин волн, называемом спектральной шириной щели. Ширина щели — важный параметр, поскольку она определяет тот диапазон длин волн, при которых на самом деле проводятся измерения. При анализе спектров используется понятие ширина полосы (ДА.) —диапазон длин волн, в котором интенсивность прошедшего света больше половины интенсивности при длине волны максимума пика. Эта величина зависит как от ширины щели S, так и от обратной линейной дисперсии материала призмы (dk/dS). Величина dk/dS, как видно из табл. 5.2, зависит от длины волны. Данные таблицы хорошо иллюстрируют также, насколько лучше в видимой области применять стеклянные призмы, чём кварцевые.
Таблица 5.2
Зависимость обратной лииейиой дисперсии от длины волны
Длина волны, нм Обратная линеВная дисперсия db/dS
кварц стекло
200 0,5 __
300 2,3 ---
400 6,2 2,4
500 12,0 5,5
600 21,5 10,0
800 40,0 24,0
1000 55,0 40,0
В качестве монохроматоров применяются также дифракционные решетки, которые представляют собой плоскопараллельную пластину с нанесенными на ней параллельными линиями — бороздками. Белый свет из-за дифракции на параллельных бороздках разлагается в непрерывный спектр. Обычно в монохроматорах сначала выделяют пучок света с определенным диапазоном длин волн с помощью призмы, а затем разлагают его еще раз решеткой. Так получают строго монохроматический свет. Основное достоинство
