Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
4. Экспериментальная ошибка ори манометрических измерениях в нормальных условиях составляет, как правило, не менее 5%, а иногда доходит до 10—20%. Как видно из уравнения (8.2), для манометрии по Варбургу количество обменивающегося газа равно произведению h на константу сосудика k. Последняя может быть определена с точностью 0,1%; отсюда следует, что эксперименталь-
Гл. 8. Манометрические методы 253
пая ошибка на самом деле определяется точностью, с которой измеряется уровень манометрической жидкости для реакционного -сосудика и термобарометра'. Точность показаний по шкале составляет не более 0,5 мм; таким образом, общая ошибка одного измерения составляет 1 мм. Относительная ошибка зависит от величины газообмена: чем больше эта величина, тем меньше ошибка. По этой причине количество биологического материала в сосудике стремятся выбрать так, чтобы h была максимально возможной, но при этом скорость газообмена между двумя фазами не превращалась в лимитирующий фактор.
?.6. Применение манометрии
8.6.1. Область применения манометрических методов
Манометрическими методами можно изучать самые разнообразные реакции. Ниже приведены некоторые наиболее характерные примеры.
1. Выделение двуокиси углерода
Глутаматдекарбоксилаза
НООССН2СН2СН (NH2) соон---------------------->
Глутаминовая кислота
---> С02 + HOOCCHaCH2CH2NHa
Т-Аминомасляная кислота
[СвНиО,------------> 2С02 + 2С,НбОН.
Глюкоза Ферментация
2. Выделение кислорода
2 Н2Оя-----:---> 2 НаО + Оа.
Каталаза
3. Поглощение двуокиси углерода
Малатдегидрогеназа
СН3СОСООН + СОа + НАДФ • Н + Н* 7 ----->•
Пяровииоградная
кислота
нооссн(он)сн2соон + надф+
Яблочная кислота
4. Поглощение кислорода
Моноаминооксидаза
RCHaNH2 + НаО + Оа----------------->-RCHO + Н2Оа + NH.,.
5. Поглощение кислорода и выделение двуокиси углерода
СвН12Ов + 60, Дыхание 6ДОа + 6НаО.
Глюкоза
254 Часть III. Аналитические методы
6. Поглощение двуокиси углерода и выделение кислорода 6 СОа 6 HjQ---------------------------*¦ C*H12Oe -f 60],
. Фотосинтез
Манометрические методы можно применять также для изучения реакций, при которых не происходит прямого изменения объема, газа, но изменяется концентрация ионов водорода. Такой реакцией является, например, реакция ферментативного образования молочной кислоты. Если эту реакцию проводить в присутствии бикарбоната, то на каждую образовавшуюся молекулу молочной кислоты будет приходиться одна молекула углекислого газа, количествокоторого можно измерить манометрически:
С,Н1аО, —> 2СН3СН(ОН)СООН
CHsCH(OH)COOH + NaHCOs —> CH3CH(OH)COONa + С02 + Н20.
Хотя исходно манометрия применялась для определения изменений содержания двуокиси углерода и кислорода, в принципе ее можно использовать для определения изменений объема любого, газа.
8.6.2. Исследования тканевых срезов и гомогенатов
Техника применения срезов тканей животных для исследования метаболизма манометрическим методом была введена Варбургом около 50 лет назад,. Она основывается на допущении, что в срезе протекают те же реакции, что и в целом органе. В некоторых случаях такое допущение спорно. В срезе не сохраняется ни иннервации, ни кровоснабжения, а газообмен ограничивается диффузией. Вполне вероятно поэтому, что в толще среза клетки находятся в анаэробных условиях, в то время как клетки поверхностных слоев подвергаются воздействию токсических концентраций кислорода, поскольку обычно в таких экспериментах инкубацию проводит в атмосфере, на 95% насыщенной кислородом. Кроме того, может сказываться отсутствие некоторых белков и гормонов, обычно содержащихся в крови и влияющих на проницаемость клеток in vivo. Как следствие этого некоторые субстраты, возможно, не смогут проникнуть внутрь клеток тканевого среза. Несмотря на все эти ограничения, данный метод оказался необычайно полезным. Ряд перечисленных выше трудностей преодолевают, приготавливая очень тонкие срезы одинаковой толщины (0,2 мм) и помещая их в соответствующую среду. Обычно это растворы Кребса—Рингера, которые по своему ионному составу приближаются к сыворотке крови млекопитающих, что позволяет сохранять целостность исследуемых клеток (разд. 1.7).
' Применение гомогенатов тканей вместо срезов частично снимает вопрос о диффузии газа к клеткам и дает возможность работать с
Гл. 8. Манометричес ие методы 255
гомогенной средой высокой концентрации, однако в гомогенате доля поврежденных клеток больше, чем в срезе, что в свою очередь является недостатком этой методики. При работе с гомогенатами также необходимо применять изотонические растворы. Тканевые гомогенаты широко используются для изучения процесса метаболизма в мышцах.
