Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
8.4. Дифференциальный респирометр Джилсона
В респирометре имеется до четырнадцати реакционных сосудиков, подобных тем, которые применяются в аппарате Варбурга, и небольшие U-образные капилляры, соединенные с одной и той же контрольной колбой через газопроводную трубку (рис. 8.2). Это устройство позволяет пропускать газ одновременно через все сосудики, однако в то же время накладывает некоторые ограничения при постановке экспериментов, в которых через разные сосудики нужно пропускать различные газовые смеси. Контрольная колба,
Гл. 8. Манометрические методы 251
имеющая значительно большие размеры, чем сосудики, предназначена для устранения влияния изменений барометрического давления и температуры водяной бани. Следовательно, необходимость в термобарометре, который нужен при манометрии по методу Варбурга, отпадает. К каждой U-образной трубке прикреплен микрометр, прокалиброванный в мкл; с его помощью, перед тем как снимать показания, доводят уровень жидкости в трубке до контрольной отметки. Это обеспечивает регистрацию изменений объема газа при постоянном давлении. Таким образом, измененйя объема газа в реакционном сосудике измеряются непосредственно, без предварительной калибровки сосудика и U-образной трубки, хотя полученные данные необходимо привести затем к с.т.д., учитывая давление паров воды внутри сосудика. Еще одно преимущество данного аппарата состоит в том, что U-образные трубки не встряхивают, как при методе Варбурга, что значительно облегчает снятие показаний.
8.5. Некоторые практические вопросы манометрии по Джилсону и Варбургу
Подготовка эксперимента и ход работы до некоторой степени зависят от особенностей изучаемой системы и используемой аппаратуры, но в общем виде включают одни и те же основные этапы.
1. Исследуемые материалы (ферменты и субстраты, клеточные органеллы, тканевые срезы, гомогенаты или микроорганизмы и субстраты) помещают в чистый реакционный сосудик в разные его части — боковые отростки, центральный цилиндрик и основное отделение сосудика.
2. Если в ходе реакции одновременно происходит и выделение, и поглощение газа (например, дыхание и фотосинтез), выделяющийся газ устраняют химическим путем. Для этого при выделении двуокиси углерода или кислорода в центральный Цилиндрик наливают соответственно концентрированный раствор щелочи или хлорида хрома. Для увеличения поверхности соприкосновения реагента с газом в центральные цилиндрики с поглощающими реагентами помещают небольшие квадратные кусочки фильтровальной бумаги — фитили.
3. Сосудик присоединяют к манометру посредством хорошо смазанного шлифа и закрепляют пружинным зажимом.
4. Затем сосудик помещают в термостатированную водяную баню и открывают кран, сообщающий его с атмосферой.
5. Если атмосфера в сосудике должна отличаться по составу от воздуха, соответствующую газовую смесь пропускают через газовый вентиль и трехходовый кран или через газопроводную трубку.
252 Часть III. Аналитические методы
6. Сосудик уравновешивают и встряхивают примерно в течение 10 мин, а затем проверяют герметичность шлифа.
7. Манометрическую жидкость подводят к точке сравнения. При манометрии по Варбургу жидкость в левом колене должна быть на низком уровне, если изучают выделение газа, и на высоком — если изучают его поглощение. Аналогичными соображениями руководствуются при установке микрометра в манометрии по Джилсону.
8. Перекрывают кран, соединяющий сосудик с атмосферой, и продолжают встряхивание еще несколько минут, чтобы удостовериться, что достигнуто равновесие (по постоянству показаний манометра).
9. Прекращают встряхивание и смешивают реагенты, быстро, но плавно наклонив сосудик. Так как при этом приходится вынимать сосудик из водяной бани, он охлаждается, и давление в нем падает, поэтому нужно следить, чтобы манометрическая жидкость не попала в сосудик. При соответствующем навыке смешивание можно выполнить быстро и без осложнений.
10. Возобновляют встряхивание и через определенные промежутки времени снимают показания.
И. При манометрии по Варбургу нужно установить соответствующим образом термобарометр.
Необходимо также иметь в виду следующее.
1. При изучении обмена двуокиси углерода pH реакционной смеси должно быть меньше 5,0, иначе двуокись углерода будет задерживаться в водной фазе в виде бикарбоната. Эти ограничения в отношении pH не относятся к методу Диккенса и Саймера (разд. 8.6.3).
2. Для изучения с помощью манометрии фотосинтеза нужно пользоваться модифицированными респираторами Варбурга или Джилсона. Водяная баня должна быть изготовлена из прозрачного материала (стекло или плексиглас) и окружена электрическими или люминесцентными лампами; для отвода избыточного тепла, создаваемого лампами, применяется элекгровентилятор и охлаждающий змеевик, помещенный внутрь бани.
3. При изучении метаболической активности срезов тканей, их гомогенатов или клеточных суспензий в отсутствие кислорода создают соответствующие анаэробные условия в экспериментальном сосудике, предварительно пропуская через него свободный от кислорода азот.
