Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
определить К для заряженных электрофоретически подвижных лигандов этим
методом нельзя).
Метод может быть также полезен для изучения взаимодействий других белков
(например, антител и ферментов) со специфическими лигандами.
7.6. МЕТАЛЛОХЕЛАТНАЯ АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Сродство белков к ионам тяжелых металлов может быть положено в основу
способа очистки и анализа этих белков [39]. Способы основаны на
образовании устойчивых комплексов гистидина и цистеина с ионами цинка или
меди в нейтральных водных растворах. В качестве избирательных сорбентов
(преимущественно для гистидин- и цистеинсодержащих пептидов и белков)
'Можно использовать гидрофильные гели с прочно фиксированными ионами Zn2+
или Си24*. Наряду с упомянутыми ионами координационные соединения с
гистидином и цистеином образуют также кадмий, ртуть, кобальт и никель.
Порат и сотр. [39] приготовили хелатообразующие сорбенты для белков и
пептидов из производных агарозы. Поскольку перечисленные ионы металлов
относятся к переходным элементам, их аффинность зависит от pH. При pH 6-8
сорбция белков избирательна для гистидина и, возможно, также для
цистеина. При щелочных pH имеет место координационное связывание
аминокислот, что приводит к более эффективной, но в то же время менее
избирательной сорбции.
Для облегчения регенерации хроматографического сорбента необходимо, чтобы
ионы металла имели более высокое сродство к гелю, чем к веществам,
подлежащим выделению. Это иллюстрируется с помощью следующей схемы:
высокий
(c)"O'(r)** + ХР ЗГ~~Р~ ~ - ">• (м)-Ь~МеЛ+ ХР
ни эн и и v-'
рн
где М-матрица геля, L - хелатообразующий лиганд, Меп+- ион металла, а X -
аффинный заместитель в белке или в пептиде ХР.
На рис. 7.5 показано разделение белков сыворотки крови ме-таллохелатной
хроматографией. В качестве гель-образующей мат-
Родственные методы аффинной хроматографии
171
рицы М использовалась оксиранактивнрованная агароза с' присоединенными
бискарбоксиметиламиногруппами (хелатообразую-щие лиганды L). Матрица
содержала связанные ионы Zn2+ и Си2+. В пиках хроматографических фракций
определен следующий состав белков: /- альбумин; II- альбумин, у-
глобулины, преаль-
Рис. 7.5. Хроматограмма, полученная элюированием колонок со связанными
Zn*+ и Cu2+ [39].
а - обе колонии промывались 60 мл 0.05 М трнс-НСЬбуфера (pH 8),
содержащего 0,15 моль/л NaCl; 6 - колонка с Си2+. Адсорбированный
материал удалялся из каждой колонки раздельно при элюировании согласно
следующей схеме: S-18 мл 0,1 М Яа*фосфаТного буфера (pH 6.5); 2- 20 мл
0.1 М Na-фосфатного буфера, содержащего 0,8 моль/л NaCl (pH 6.5); 3-17 ыл
0.1 М Na фосфатного буфера, содержащего 0,8 моль/л NaCl (pH 4,5): 4 - 25
мл 0,05 М ЭДТА. содержащего 0,5 М NaCl (pH 7,0); в - колонка с Zna+; 5 -
47 мл 0,1 М Na-фосфатлого буфера (pH 6,5); 6 - 38 мл 0,1 М Na-
фосфатного буфера, содержащего
0.8 моль^л NaCl (pH 6,5); 7 - 12 мл ОД М Na-ацетатного буфера,
содержащего 0.8 моль/л NaCl (pH 4,5); 3-10 мл 0.5 М ЭДТА, содержащего 0.5
иоль/л NaCl (pH 7,0).
бумин, следовые количества ещантитрипсина; III- альбумин, трансферин,
гаптоглобины, {3-липопротеин, следовые количества у-глобулинов; IV -
трансферин, ai-антитрипсин, кислый гликопротеин, у-глобулины,
церулоплазмин; V - трансферин, следовые количества гемоглобина, следовые
количества у-глобулина; VI - "г-макроглобули-н, следовые количества
гемоглобина. В ходе хроматографии ни один из компонентов не
денатурировал, Металло-хелатный гель сохранял свою адсорбционную
способность даже в 1 ,\V хлористом натрии, который исключал возможность
обычной ионной адсорбции, имеющей место на этом геле.
На основании ориентировочных опытов установлено, что из аминокислот,
присутствующих в белке, наиболее сильно сорбируются гистидин и цистеин.
При pH 8-9 адсорбируются также другие аминокислоты, но при понижении pH
они десорбируются значительно раньше, чем гистидин. Следовательно, можно
предположить, что хроматографическое поведение белков преимущест-
172
Глава 7
венно обусловлено количеством и плотностью экспонированных имидазольных и
тиольных групп на поверхности молекул. Могут также играть роль индольные
группы.
Адсорбционная емкость хелатов по белкам сыворотки крови понижается в
следующем ряду металлов: Cu>Zn>Ni>Mn.
Очень эффективны хелаты меди, в то время как марганецхелат-ный гель имеет
ничтожную адсорбционную емкость. Значительная адсорбционная емкость и
разделяющая способность некоторых гелей делают их пригодными при
разделениях веществ в крупном масштабе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Asliant У., Wilson 1, В., Biochim. Biophys Acta, 276, 317-322
(1972).
2. Barnes I, D., Kuehn G. D., Atkinson D. E., Biochemistry, 10, 3939-
3944
(1971).
3. Bertrand O., Kahn A., Cottreau D., Boioin P., Biochimie, 58, 261-267
(1976).
4. Bigelis R., Umbarger H. E" J. Biol. Chem., 250, 4315-4321 (1975).
5. Btumberg P. М., Strominger J. L., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 69, 3751
- 3755 (1972).
6. Btumberg P. М., Strominger J. L., Methods Enzymol., 34, 401-405
