Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть
либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель {последнее
обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое
использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой
работе еще не введен термин "аффинный электрофорез"): константы
диссоциации комплексов фосфорила-за - полисахарид определены с помощью
электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации
ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез
на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения
констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными
гликопротеинами.
Принцип аффинного электрофореза может быть использован не только для
определения 'констант диссоциации комплексов белков со связанными
лигандами, но также и для определения констант диссоциации комплексов со
свободными лигандами. Подвижность белковой зоны при электрофорезе на
аффинном носителе повышается в зависимости от концентрации свободного
специфического лиганда. Таким образом были определены константы
диссоциации комплексов лактин - сахар [64].
Для приготовления сорбента, содержащего сахар, получают полиакриламидный
гель сополимеризацией акриламида, N, N'-метиленбисакриламида и
аллилгликозида. Остающийся мономерный аллилгликозид удаляют, гель
уравновешивают буферным раствором, в котором проводят электрофорез, и
вводят снова в трубку. Приготовить растворимый сополимер акриламида с ал-
лилгликозидом технически проще; он может быть лиофильно высушен, причем
продукт характеризуется известным содержанием сахара и определенной
молекулярной массой. Необходимое количество этого сахаридсодержащего
полимера с определенным содержанием связанного сахара добавляют к
полимеризационной смеси, обычно используемой при получении
полиакриламидного геля. Кроме того, данное количество свободного сахара
добавляется также к полимеризационной смеси и гель оставляют полиме-
ризоваться. Таким способом готовят набор трубочек геля с постоянной
концентрацией связанного сахара и с возрастающими концентрациями
свободного сахара.
Зависимость измеренных подвижностей лектинов в гелях, приготовленных этим
способом {с известной концентрацией свобод-
Родственные методы аффинной хроматографии
169
ного сахара), подчиняется соотношению
(7.4)
где К,-жонстанта диссоциации комплекса лектин - связанный сахар; К -
константа диссоциации комплекса лектин - свободный сахар; а -
концентрация связанного сахара; с - концентрация свободного сахара; / -
подвижность лектина при данных а и с, /о - подвижность лектина в
отсутствие взаимодействия со связан* ным сахаром (получается путем
аппроксимирования I к высо-кнм концентрациям с; может быть найдена также
при электрофорезе в геле, содержащем инертный полиакриламид).
Это соотношение прямо вытекает из уравнения, выведенного Данном и
Чейкеном [13] для определения констант диссоциации с помощью аффинной
хроматографии. Таким способом были получены константы диссоциации
комплексов конканавалина А и лектина из семян Lens esculenta с метил-ct-
D-маннопиранозидом, метил-а-о-глюкопиранозидом, d-глюкозой и метил-р-о-
глнжопи-ранозидом, а также константы диссоциации комплексов лектинов из
семян Glycine soja, Ricinus communis и Maclura pomifera с d-галактозой и
лектинов из семян Ulex europeus и сыворотки крови угря с ь-фукозой.
Найденные величины (имеющие порядок 10-2- 10-4) согласуются со
значениями, полученными с помощью других методов (равновесным диализом,
спектроскопическими методами и т. п.).
Найдено, что почти во всех случаях Ki ниже (в 5-10 раз), чем К, для того
же свободного сахара, что, очевидно, является следствием того, что
исследованные лектины имеют более одного связывающего центра. Используя
аффинный электрофорез, можно определять относительно высокие константы
диссоциации (например, для взаимодействия одного из изолектинов сыворотки
крови угря с ь-фукозой найдена константа диссоциации К= ~2-Ю~2 моль/л).
Теоретически можно изучать также взаимодействия, по крайней мере в
десятки раз более слабые.
Аффинный электрофорез дает следующие преимущества при определении
констант диссоциации:
а) небольшие количества образца, который может даже быть весьма
негомогенным;
б) одновременное определение Кi и К для всех элвктрофорети-чески
отличающихся компонентов, взаимодействующих с изучаемым лигандом,
присутствующим в образце (например, для изолектинов) ;
в) для всех Ci и с полосы резкие, и их положение можно хорошо определить
(в аффинной хроматографии имеет место значительное уширение пиков при
низких с); наиболее узкая полоса
170
Глава 7
наблюдается при с=0, т. е. тогда, когда в аффинной хроматогра фии анализ
положения пиков вообще невозможен;
г) быстрота метода, простота лабораторного оборудования одновременный
анализ большого количества образцов;
д) широкий диапазон К и Кг, возможность определения высоких К (однако
