Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
аффинным сорбентом используют подходящую химическую реакцию. Пример
ковалентной аффинной хроматографии-'Выделение ацетилхолинэстеразы с
помощью иммобилизованных органофосфагов [1, 56]. Ацетилхолинэстераза
принадлежит сериновым эстеразам, для которых типично ингибирование
связыванием с органофосфатами или органофоофонатными эфирами, содержащими
легко отщепляемую группу, например,
Реакция обратима, но равновесие сильно смещено вправо, как
это следует из величин констант скорости второго порядка (л •моль-'1-мин)
для ацетилхолинэстеразы из электрического угря. Следовательно, реакция
обычно протекает в одном направлении. Гидроксильная группа активного
серина является нуклеофилом фермента, и эта группа ацетилируется в ходе
гидролиза ацетилхолина. Фосфорилированный фермент относительно устой-
С1Н5о''
P-F + Е
CjHsO ft
kr=tO CjHso'
P-E + F
Родственные методы аффинной хроматографии
159
чив и гидролизуется в водном растворе крайне медленно. Однако при
добавлении в раствор сильного нуклеофила, такого, как N-метилпиридиний-2-
альдоксим (2-МПА), последний очень быстро реагирует с ингибированным
ферментом с освобождением фермента.
Выделение ацетилхолинэстеразы на ковалентном аффинном носителе проводится
по следующей схеме:
Седзароза-
О О'
NHfCHpsNHC-CHjCh^C
NHCHjCHj-O-P- O-ejV
сщ w
NO,
Ацепнлхалихэстераза, + Белки + Другие нереаеирующие вещества
0 .
Севзароза-Ножна-мнсн.сн.-о-р-о-лмюгА но-f чУмо,+ белки\gpyiue
яереагиршщие
1 W вещества
зстераза
г-ПАМ
О
п
Серараза-Хожяа-гмнснгснг-о-р-он * Ацетилхолинэстераза
сн5
На первой стадии колонка должна быть обработана смесью
ацетилхолинэстеразы и других белков. Ацетилхолинэстераза и другие
сериновые эстеразы связываются ковалентно, а непрореагировавшие белки
отмываются с колонки. На второй стадии колонка обрабатывается раствором
2-МПА, избирательно отщепляющим ацетилхолинэстеразу. Аффинный носитель
связывает аце-тилхолинэстеразу, химотрипсин и, возможно, и другие
сериновые эсторазы, которые быстро реагируют с лигандом. Для отщепления
фермента, ковалентно связанного с ингибитором, можно использовать
фториды, но для практических целей применяют более активные нуклеофилы,
например уже упомянутый N-метилпири-диний-2-альдоксим. При низкой
скорости потока, которая позволяет ферменту оставаться в контакте с
иммобилизованным "необратимым" ингибитором с концентрацией -~20 мкмоль/л
в течение по крайней мере 3 мин, весь фермент связывается. Такое
взаимодействие соответствует реакции второго порядка с константой
скорости >105 л-моль-1-мин-1. Если фермент полностью за-ингибирован
органофосфатом перед его нанесением на аффинный сорбент,
ацетилхолинэстераза совсем не адсорбируется на колонке. Емкость
ковалентной аффинной колонки весьма высока. Если концентрация связанного
аффинного лиганда в геле равна 0,2 ммоль/л, то 1 мл геля связывает 0,1
мкмоль химотрипсина, т. е. 2,5 мг белка. На колонке с 1 мл геля можно
получить 1 мг ацетилхолинэстеразы при концентрации связанного с сефарозой
ингибитора 0,5 ммоль/л.
160
Глава 7
Другой пример ковалентной хроматографии, а именно тиолди-сульфидный
обмен, применяемый для выделения белков и пептидов со свободными SH-
группами, уже рассмотрен в разд. 6.6.
Бламберг и Строминджер [5, 6] применили ковалентную аффинную
хроматографию для выделения пенициллинсвязывающих компонентов мембран из
солюбилизированных мембран Bacillus subtilis. Мембраны солюбилизировались
с помощью 2%-ного но-яидета Р-40 и экстракт сорбировался на 6-
аминопеницилланаг - сефарозе одноразовым методом при комнатной
температуре. Пе-нициллиновязывающие компоненты образуют ковалентную связь
с .пенициллином, которая, по-видимому, является тиоэфирной связью между
остатком цистеина белка и карбонильной группой р-лактамного кольца
пенициллина. Пенициллинферментная связь может быть затем расщеплена при
помощи мягкой обработки гид-роксиламином в нейтральной среде. Ферменты,
полученные таким способом, главным образом D-алашшкарбоксипелтидаза из
Bacillus subtilis, полностью сохраняют свою ферментативную активность.
Примеры выделения веществ при помощи ковалентной аффинной хроматографии
также даны в табл. 11.1.
7.3. АФФИННОЕ ЭЛЮИРОВАНИЕ
Другим методом аффинной хроматографии, использующим образование
специфического комплекса макромолекулы выделяемого вещества с аффинным
лигандом, является биоспецифическое , элюирование с неспецифических
сорбентов; этот метод известен как "аффинное элюирование" и в некоторых
случаях как "специфическое элюирование субстратом" [54]. В основе метода
лежит неспецифическое связывание, например, смеси ферментов полимером,
который несет на себе функциональные группы, взаимодействующие с
ферментами. Требуемый фермент затем специфически элюируют раствором
субстрата, ингибитора или какого-либо другого аффинного лиганда.
В методе аффинного элюирования наиболее часто используемыми полимерами
являются ионообменники. Если сорбируемая молекула связывается с помощью
