Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Носитель К-МДА получается из диальдегидкрахмала (продукта периодатного
окисления крахмала) путем конденсации с 4,4/-диамииодифенилметаном
(метилендианилином) и последующим восстановлением образующихся шиффовых
оснований [23]
о-
+ NH,-
4,4-диаминодифШ/гме/пан
диальдегидхрахмал
182
Глава 8
CHgOH
I
снгон
н>-Он hJ-4H
_T LoJlU..
CH HC
U II
0 N 0
NH* NH;
- O-
cHjOH
н/1-^-Q.h ? >-о
CHiHjC NH NH
NHj NHt
O-
NH OH
i I
CH^HjC
о-
~Чн
н> о H
CH^O'H
Для связывания с белками носитель сначала превращается в соли диазония
No NO;
HCl
¦CHrNH-Q-CH,-^-Nt*cr
.CH.-NH-Q СНг-^Ь N,+Cr
Емкость по диазотированию носителя К - МДА составляет 0,24-0,26 мэкв./г,
а максимальная емкость по связыванию бел-ков - 80-100 мг/г. Носитель К -
МДА используется преимущественно для связывания ферментов. Известен,
например, К-МДА- меркурипапаин [94]. Диальдегидкрахмал выпускается фирмой
Miles Chemical Со (США) под названием Sumstar 190.
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
183
8.2.3. Декстрановые гели
Декстран -это полисахарид с разветвленными целями из остатков глюкозы,
продуцируемый в растворах, содержащих сахар, различными штаммами
Leuconostoc mesenteroides. Растворимый декстран, приготовленный дробным
осаждением спиртом частично гидролизованного неочищенного декстрана,
содержит >90% "-1,6-глюкозидных связей и разветвляется, образуя 1,2-,
1,3- и 1,4-глюкозидные связи. Сшитый 1-хлор-2,3-эпоксипропаном в щелочном
растворе, декстран представляет собой трехмерный гель, структурный
фрагмент которого приведен ниже
-о-сн2
Основной производитель декстрановых гелей (сефадексов) фирма Pharmacia
(Швеция). Гели очень устойчивы к химическому воздействию; например,
выдерживание в течение 2 месяцев в 0,25 М NaOH при 60 °С не оказывает на
них никакого влияния. Пр и низких pH глюкозидная связь чувствительна к
гидролизу; несмотря на это, декстрановые носители устойчивы при 6-
месячном выдерживании в 0,02 М НС1 или 1-2-часовом - в 0,1 М. НС1 или в
88%-ной муравьиной кислотой [41]. Под действием окислительных агентов
образуются альдегидные и карбоксильные группы. При изучении термической
устойчивости гелей обнаружено, что в растворе они могут выдерживать 40-
минутное нагревание в автоклаве при 110°С, а в сухом виде - нагревание
при 120 °С. Высушивание и набухание в воде обратимы. Гели до ол,-
ределенной степени набухают даже в спирте, этиленгликоле, фор-мамиде,
ГфЫ-диметилформамиде и диметилсульфоксиде."
Присоединение аффинных лигандов к декстриновым гелям может быть
осуществлено с помощью ряда методов, описанных для целлюлозы, а также
агарозы (см. ниже), а именно: связывание после активации бромцианом,
триазиновый метод, связывание с использованием эпоксидов или
бифункциональных производных или связывание через ацилазидные
промежуточные соединения.
184
Глава 8
Простой метод привяжи белков к нерастворимым полисахаридам описан
Сандерсоном и Уилсоном [63], Ниже приведена соответствующая схема
последовательных реакций
сн4он
-о- окисление
-о
HOCHj снгон
Полисахариды "активировались:" окислением путем одночасовой обработки
0,01-0,5 М перйодатом натрия. Образующийся альдегид реагирует с белком.
10 мг окисленных полисахаридов, промытых водой с помощью
центрифугирования. суспендировались в 1 мл забуференного фосфатным
буфером (pH 8) физиологического раствора, содержащего 10 мг бычьего
сывороточного альбумина, и непрерывно перемешивались в течение 20 ч.
Последующее восстановление боро-гидридом натрия (свежеприготовленным 1%-
ным раствором) привело, к стабилизации связей между белком и
полисахаридом и к восстановлению остающихся альдегидных групп.
Использование декстриновых гелей частично ограничено из-за их
относительно низкой пористости (разд. 5.1). Примеры их использования для
аффинной хроматографии даны в табл. 11.1. Они широко применяются
непосредственно (без какой-либо модификации) в качестве специфических
сорбентов для выделения ряда лектинов.
8.2.4. Агароза и ее производные
Агароза - линейный полисахарид, построенный из чередующихся остатков d-
галактозы и звеньев 3,6-ангидро-l-галактозы
-о
D-галактоза 3,6-ангидра-1?гадантоза,
является в настоящее время наиболее распространенным носителем для
аффинной хроматографии. Как показали Куатреказас и Анфинсен [13], агароза
удовлетворяет почти всем требованиям идеального носителя.
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
185
Главными производителями агарозы являются фирма Pharmacia (Швеция),
выпускающая ее под названием сефароза, и Bio-Pad Labs. (США) - под
названием биогель А.
Сефароза - это гель агарозы со сферическими частицами; в продажу
поступает в виде суспензии в воде (в набухшем состоянии), содержащей
0,02% азида натрия в качестве бактериостати-ческого агента. Первыми в
продаже появились следующие три типа сефароз: 1) сефароза 6В - гель,
соответствующий ~6%-ной агарозе; набухшие гранулы размером 40-210 мкм;
применяется для фракционирования веществ с молекулярной массой 105- 10е;
