Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
влияет на удерживание фермента.
3. Бесконкурентное действие. Если устойчивость тройного комплекса ELI
выше, чем двойного EI, то присутствие свободного ингибитора I уменьшает
долю фермента в подвижной фазе и повышает связываемость фермента. Если
тройной комплекс ELI менее устойчив, чем двойной EL, увеличение
концентрации свободного аффинного лиганда приведет к элюированию
фермента.
В литературе можно найти много примеров элюирования кон-^чповтпчми
лигянтями. R гл. 10 (оис. 10.5) описано выделение
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
93
трипсина и химотрипсина из панкреатических экстрактов, проро-димое на
сефарозе со связанным ингибитором трипсина. Химотрип-сип снимается с
колонки раствором конкурентного ингибитора - триптамина, а трипсин
элюируется раствором бензамидина. В гл.З имеется указание на то, что для
элюирования ферментов с аффинной матрицы раствором конкурентного
ингибитора важно, чтобы концентрация последнего была выше, чем
концентрация аффинанта, прикрепленного к матрице. Это справедливо в
предположении, что оба {свободный и связанный ингибиторы) имеют
приблизительно равное сродство к выделяемому ферменту. Можно также
элюировать фермент раствором аффинанта, имеющего более высокое сродство.
Во многих случаях элюирование специфически сорбированных ферментов
буферными растворами,, содержащими высокие концентрации конкурентного
ингибитора, приводит к получению более разбавленных растворов фермента,
чем при элюировании изменением pH или ионной силы раствора. Это явление
особенно выражено в системах с высоким сродством, когда элюирование с
аффинного сорбента может представлять собой зависимый от времени процесс
даже при использовании высококонцентрированных растворов конкурентного
аффинанта в буфере [19]. Диссоциация фермента из стационарной фазы -
процесс первого порядка, и скорость зависит только от концентрации
комплекса и не зависит от концентрации свободного конкурентного
ингибитора. Свободный субстрат или ингибитор снижают тенденцию фермента к
образованию нового ассоциата с'иммобилизован-ным лигандом, поскольку
фермент преимущественно переходит в растворимый комплекс; при этом
предполагается, что субстрат или ингибитор находятся в достаточно высокой
концентрации.
Если аффинность комплекса очень высока {/Cl^IO 7 моль/л), для полной
диссоциации комплекса требуется значительное время. Время, необходимое
для ассоциации половины первоначально связанного с иммобилизованным
аффинным лигандом фермента, называется временем полупревращения ti/ ,
которое определяется выражением
где [?]-концентрация свободного фермента, Ео - начальная концентрация
связанного фермента, a fc_i- константа скорости
Элюирование будет независимым от времени, если после внесения
растворимого ингибитора временно прекратить поток в колонке. Момент
остановки потока определяется величиной k-u значение которой трудно
найти, поэтому на практике этот момент подбирается более или менее
эмпирически. Другой способ уско-
1п Еп![Е] _ 1п2 _ 0,693
Ej 1.-| i
(5.4)
диссоциации комплекса ( E + L
94
Глава 5
рения специфического элюирования состоит в одновременном изменении pH,
ионной силы и температуры. Поскольку аффинность сорбентов снижается при
повышении температуры, нагревание может существенно повлиять на
элюирование конкурентным ингибитором. Действие различных элюентов на
лактатдегидрогеназу, удерживаемую на АМР - сефарозе [28], показано на
рис. 5.17.
Рис. 5.17. Эффективность различных элюирующих систем для десорбции
лактатдегидрогеиазы из сердца быка, связанной на колонке (40X15 мм) с
АМР-сефарозой (1,0 г влажного геля) [28].
Фермент (0,1 мг) в 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,5) наносился на
коЛоня>. Для элюирования использовались следующие буферные смеси: /-0,5
мМ NAD4+0,5 иМ L-лактат; 2 - 0,5 мМ КАО++0,5 мМ пнруват; 3 - 0,5 мМ
окисленный аддукт NAD4-пнруват; 4 - 0.5 мМ NADH, Стрелки указывают
ударное введение 2.0 мл 10 мМ NADH для обеспечения элюирования
оставшегося связанного фермента. При расчете количества фермента
вводились поправки на ингибирующее действие. Объем фракции 5,5 мл;
скорость потока 6 мл/ч,
В то время как элюирование лактатдегидрогеиазы 0,5 мМ NADH
происходит количественно за 1 ч, только 30% фермента элюируется через 20
ч раствором 0,5 мМ NAD+ + 0,3 мМ L-лактат,
5.8. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ВЛИЯНИЯ
Эффективность аффинной хроматографии снижается в основном из-за
неспецифической сорбции инертных веществ. Неспецифические эффекты, как
правило, очень слабы и проявляются главным образом во взаимодействующих
системах с низким сродством.
5.8.1. Влияние на неспецифическую сорбцию ионной силы
До последнего времени основной причиной неспецифической сорбции считался
ионный обмен. Как правило, полагали, что при исключении ионных групп из
материала матрицы и введении пространственных групп мешающие эффекты
могут быть преодолены. Конечно, во многих случаях аффинные лиганды сами
имеют ионогенные свойства и могут связывать, осуществляя ионный обмен.
