Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
58,8 кДж/моль (14,1 ккал/моль), соответственно выше и ниже температуры
перехода (15 °С). Причиной такого поведения может быть конформационное
изменение фермента, индуцируемое температурой. Та же энергия адсорбции
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
"7
глицерокиназы получается, если температура изменяется от 35 до 0,5 °С. Из
этих результатов следует, что даже длительное выдерживание колонок при
повышенной температуре не изменяет их последующего хроматографического
поведения при низкой температуре. Приведенные выше значения кажущихся
энергий адсорбции рассчитаны без учета влияния температуры на ионную силу
элюемта. Если принять во внимание и этот фактор, то уточ-
Рис. 5.П. Влияние температуры на емкость №-{6-аминогексил)-5'-АМР-
сефарозы |9].
Образец (100 мкл), сиржащнй 5Е фермента н 1,5 мг бычьего сывороточного
альбумина, наносился на колонк\- (30X5 мм) с 0,5 г >1в-(6-амнкогексил)-
5'-АМР-сефарозой. Методику ся. в подписи к рис I !• Емкость определялась
по проценту ферментативной активности, одерживаемой сорбии."м. Бычий
сывороточный альбумин обнаружен в свободном объеме колонки. Концентрации
иммобилизованного лиганда для дрожжевой алкогольдегидрогеназы составляла
1,5 мкмоль мл АМР (/), для глицерокиназы 1,5 мкмоль/л АМР (2) и 4,0
мкмоль/мл
AMP (J).
пенная энергия адсорбции глицерокиназы составит 8,3 кДж/моль (2,0
ккал/моль).
Связывание лактатдегидрогеиазы па Ы6-(6-аминогексил)-5'-АМР - сефарозе
настолько сильно, что фермент нельзя элюировать даже 1 М КС 1 при 40 "С.
Однако для элюирования можно использовать линейный градиент концентрации
NADH. На рис. 5.12 показан график зависимости концентрации NADH,
необходимой для элюирования лактатдегидрогеиазы, от температуры, С
повышением температуры необходимая концентрация специфического
элюирующего агента уменьшается, что отражается линейным графиком
Аррениуса. Соответствующая энергия адсорбции составляет 54,6 кДж/моль
(13,0 ккал/моль) [9].
85
Глава 5
На рис. 5.13 показано влияние температуры на связываемость (} ферментов
термофильного микроорганизма - алкогольдегидро-геназы и фосфофруктокиназы
из Baccillus stearoihermophilus - на Ы6-(б-аминогексил)-5'-АМР- сефарозе
[2J. Для упомянутых ферментов термофила связываемость р, напротив,
первоначально
Рис. 5.12. Связываемость р лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи на
Мв-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозе в зависимости от температуры [9].
Образец (100 мкл), содержащий 5 Е фермента н 1.5 мг бычьего сывороточного
альбумина, наносился на колонку (50X5 мм) с 0,5 г
М*(6"аминогекснл)'5'*АМР-сефарозой (1,5 мкмоль/Мл AMP). Q - методику см.
а подписи к рнс. 4.6; элюирование осуществлялось в линейном градиенте
концентрации <0-5 ммоль/л) NADH (общий объем элюата 20 мл); 6 - график
Аррениуса по тем же данным.
увеличивается с ростом температуры. Выше 50 °С уже происходит деструкция
геля, которая обнаруживается по присутствию в элюа-те нуклеотида. Данные,
приведенные на рис. 5.14, а и б, показывают, что связываемость р для
обоих ферментов на иммобилизованном АМР также зависит от температуры [2];
на рис. 5.14,6 дана зависимость от температуры точек перегиба кривых
связываемость- pH (кажущиеся величины рК).
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
89
Рис, 6.13. Влияние температуры на связываемость |3 алкогольдегидрогеназы
(/) и фосфофруктгжиназы (2) на Ы6-(6-аминогексил)-5'-АМР-сефарозе [2].
Проводился диализ экстракта фермента (0,5 мл), содержащего 81 Е
фосфофруктокинааы. 20 Е нлн 18,7 мг/мл алкогольдегидрогеназы, против 10
мМ К-фосфатного буферного раствора (pH 6,8); затем раствор пропускался
через колонку с замещенной АМР-сефарозой, Элюнро панне осуществлялось в
линейном градиенте концентрации (0-1 ноль'л) КС1 (обший объем элюата 40
мл) в 10 ыМ К фосфатном буфере; скорость потока 0,4 мл/мни.
Рис, 5.14. Зависимость связываемости р алкогольдегидрогеназы (а) и фосфа-
фруктокиназы (б) на №-(С-амнногексил)-5'-АМР-сефарозе от pH п связь
кажущихся рА (абсцисса в точках перегиба на рис. я и б) и температур
связывания алкогольдегидрогеназы (/) ц фосфофруктокиназы (2) (в) [2],
Условия см, в подписи к рис. 5.13: 10 мМ трис-фосфат доводился до
требуемого pH при соответствующей температуре.
Влияние температуры на сорбцию и элюирование выделяемых аффинной
хроматографией веществ рассмотрено далее (гл. 10). В заключение этого
раздела следует подчеркнуть, что всегда следует помнить о влиянии
температуры, поскольку воспроизводимые результаты можно получить, только
если температура тщательно контролируется; особенно это касается
аналитических приложений аффинной хроматографии.
90
Глава 5
3.6. ВЛИЯНИЕ pH И ИОННОЙ силы
Каталитическое действие ферментов обычно ограничено узким интервалом
оптимума pH, который зависит от ионизации и фермента, и его субстрата.
Отклонение от этого интервала pH приводит к снижению как скорости
ферментативной реакции, так и аффинности системы по субстрату. Ионные и
гидрофобные взаимодействия с субстратом или ингибитором, осуществляющиеся
