Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
отражающая влияние гидрофобных взаимодействий. Константы А и В являются
функциями диэлектрической проницаемости D, температуры раствора Г (°С) и
ионного радиуса а (А):
А = 1,8246 ¦ 10 9l(DTfi\ (5.9)
В=50,29а/{?>7')1/2. (5.10)
Можно предположить, что при взаимодействии фермента с лигандом заряд
фермент-лигандного комплекса равен сумме зарядов фермента и лиганда:
2el=^e + Zl (5.П)
и что А и В постоянны для всех компонентов. Тогда уравнение
(5.8) для коэффициентов активности всех компонентов можно
написать в виде
1е(*,Ж)= (5.12)
где
Ko=KEL~KE-KL (5.13)
п а
98
Глава 5
может принимать положительные, отрицательные или равные нулю значения.
Таким образом, логарифм измеряемой константы равновесия [lg {KdK) ]
растет с увеличением ионной силы раствора при ее низких величинах, но при
высоких значениях ионной
Рис. 5.19. Влияние ионной силы раствора на отношение констант равновесия
для десорбции р-галактозидазы в К-фосфатном буферном растворе (pH 7,5)
[23].
силы уменьшается (если /Со<10) - Если Ко>0, для больших Is величина
\g(Kc/K) продолжает расти с увеличением /s, однако если Ко = 0, то
lg(7Cf//C) остается постоянным:
lg (Кс/К) " ~2AbEZl + Vs (при в УХ" 1). (5.14)
Зависимость отношения констант равновесия от ионной силы для десорбции
.р-галактозидазы приведена на рис. 5.19; форма кривой находится в хорошем
соответствии с предсказаниями, основанными на уравнении (5,12), Константы
А я В, а также Ко- обычно полуэмпирические параметры. Из рис. 5.19 видно,
что линейный участок, предсказываемый уравнением (5.14), начинается при
ионной силе >0,8. При более низких значениях ионной силы
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
99
связывание обусловлено преимущественно электростатическими силами. Это
справедливо, если на Кс определяющее влияние ока-зывает первый член в
правой части уравнения (5.12). Тангенс угла наклона прямолинейного
участка кривой является константой гидрофобного связывания Ко [уравнение
(5.14)]. Продолжение прямолинейного участка отсекает па оси ординат
значение -2A2eZl/R
Подобные исследования с сывороточным альбумином и лизо-цимом показали
непрерывное увеличение константы связывания сывороточного альбумина при
увеличении ионной силы. Для сывороточного альбумина даже при высокой
ионной силе ДГо>0. в то время как для лизоцима Ко, очевидно, очень близка
к нулю, о чем свидетельствует постоянство Кс при больших значениях Д. Для
того чтобы определить, будут ли совпадать величины Кс при достижении
одной и той же ионной силы раствора по пути повышения или понижения
ионной силы или в зависимости от этого будет иметь место установление
нового равновесия, Морроу и др. [23] провели эксперимент, результаты
которого показаны на рис. 5.20. Кривая / относится к ферменту,
первоначально связанному при ионной силе 1,8, а кривая 2 - к ферменту,
связанному при очень низкой ионной силе. Наблюдаемый гистерезис
свидетельствует о различии, зависящем от направления достижения заданной
ионной силы раствора. Тем не менее результаты обоих экспериментов
согласуются с предсказаниями, сделанными на основании уравнения (5.12).
Если известна общая эффективная концентрация лиганда, способного
связывать фермент (8 мкмоль в 1 мл геля), то можно определить расстояние
между "ножками", на которых молекулы лиганда прикреплены к гелю; оно
равно ~29 А. Поскольку диаметр молекулы р-галактозидазы ~ 140 А, можно
сделать вывод, что приблизительно 19 "ножек" (пространственных групп)
могут взаимодействовать с каждой молекулой белка. Это объясняет, почему в
замещенных гелях настолько сильно проявляются неспецифические
электростатические и гидрофобные взаимодействия. Если к этим
пространственным группам привязан ингибитор, можно ожидать более
специфических взаимодействий фермента с сорбентом при низком уровне
модификации геля лигандом.
Используя постоянно перемешиваемый реактор и основываясь па расширенной
теории Дебая - Хюккеля, Морроу и др. .[23] показали. что адсорбция
фермента более обратима при низких ионных силах раствора, в то время как
при высокой ионной силе этот процесс становится по существу необратимым.
С понижающимся линейным градиентом ионной силы десорбция фермента в
постоянно перемешиваемом реакторе зависит от времени. Кроме того,
показано, что присутствие других белков, например гемоглобина, не влияет
на результаты.
100
Глава 5
Рис. 5.JO. Гистерезис зависимости Ка от ионной силы раствора для р-
галакто-
зидаэы [23J.
/ - первоначальное связывание при высокой ионной силе: 2 - при низкой
ионной силе.
О'Карра и др. [26] изучали адсорбцию глицеральдегид-3-фос-
фатдегидрогеназы на полимере
Я 0
|-NH-(СНг>6-NH-C>^~^-N=N-NAD*
и обнаружили, что количество фермента, способного к элюированию, зависит
от времени, в течение которого фермент находился в контакте с замещенным
носителем. Выход фермента, элюируемого с помощью NAD+, понижается с
увеличением времени, в течение которого фермент остается адсорбированным
