Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
пирофосфат -сефарозы при разбавлении разными количествами
немодифицироваиной сефарозы на примере взаимодействия с миокиназой хорошо
видны в табл. 5.2 [8], Разбавление аффинным сорбентом ведет к уменьшению
связываемости р, выраженной через концентрации хлорида калия, которые
необходимы для элюирования фермента. Емкость сорбента, выраженная в
единицах активности фермента, сорбированного на 1 мкмоль нуклеотида,
возрастает при низких концентрациях нуклеотида, хотя абсолютная емкость
на 1 г материала колонки с разбавлением уменьшается.
Зависимости связываемости р лактатдегидрогеназы от концентрации лиганда в
Ы6-(6-аминогексил) -5'-АМР - сефарозе, разбавленной незамещенной
сефарозой до требуемой концентрации лиганда, и от той же концентрации в
сефарозе, равномерно модифицированной N6-(6-аминогексил)-5'-АМР, близки
[8]. Более сильная связываемость в случае сорбента, разбавленного
незамещенной сефарозой, объяснена присутствием гранул геля, в которых
концентрация лиганда остается идентичной той, которая была в исходном
неразбавленном геле. В гелях, которые содержали равномерно распределенный
лиганд, связываемость (5 лактатде-
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
79
гидрогеназы, малатдегидрогеназы и глицсрокиназы линейно возрастает с
увеличением концентрации N6-(6-аминогексил)-Б'-АМР; иммобилизованного на
сефарозе (рис. 5.8) [8].
Если концентрация лиганда N6- (6-аминогексил)-5'-АМР, иммобилизованного
на сефарозе, и общее содержание лиганда постоянны, а меняется высота слоя
геля при использовании разного диаметра колонок, связываемость fi
алкогольдегидрогеназы, а так-
Рис, 5.8. Связываемость [5 малатдегидрогеназы (/), лактатдегидрогеиазы из
мышцы сердца свиньи (2) и глицерокиназы (3) на N6-(6-аминогексил)-б'-АМР-
сефарозе в зависимости от концентрации аффинного лиганда [8].
Образец (100 мкл) фермента (5 В) наносился на колонку (50X5 мм) с 0.5 г
сефарозы 411, содержащей различные концентрации присоединенного М6-(б-
аминогексил)-5''АЛФ.
же глицерокиназы возрастает с увеличением высоты геля в ко-лонке [21].
Если общее содержание аффинанта постоянно п колонки имеют один и тот же
диаметр, связываемость р лактатде-гидрогеназы и глицерокиназы на Ы6-(6-
амипогексил)-5/-АМР - сефарозе прямо пропорциональна концентрации лиганда
и, следовательно, в этом случае косвенно зависит от высоты колонки,
уменьшаясь с уменьшением концентрации лиганда. Если же высота колонки
увеличивается, в то время как концентрация аффи-напта и диаметр колонки
сохраняются постоянными, так что общее количество аффинного лиганда
пропорционально высоте колонки, связываемость р лактатдегидрогеиазы и
глицерокиназы линейно зависит от высоты колонки'. Емкость колонки в тех
же условиях (т. е. при постоянной концентрации лиганда и постоян-
80
Глава 5
ном диаметре колонки) также линейно зависит от высоты колонки и, таким
образом, от общего содержания лиганда в колонке.
Геометрия колонок, концентрация и общее содержание аффинного лиганда -
вот три основных параметра, которые определяют и связываемость, и емкость
носителя. Для систем с высокой аффинностью высота колонки с аффинным
сорбентом, содержащим высокие концентрации лиганда, мало влияет:
связываемость зависит от концентрации аффинанта, а не от высоты колонки.
Это имеет практическое значение: колонки, содержащие высокие концентрации
лиганда, можно использовать для концентрирования разбавленных растворов
ферментов. Кроме того, в системах с высокой аффинностью, в которых
элюирование адсорбированных макромолекул без денатурации затруднено,
разбавление аффинного сорбента немодифицированным гелем или уменьшение
концентрации лиганда может способствовать элюированию в более мягких
условиях. В некоторых случаях, конечно, фермент различает только
концентрацию лиганда в гранулах модифицированного геля, которая, однако,
не меняется при разбавлении. В таких случаях трудности элюирования
остаются даже после разбавления геля [И]. Для взаимодействий систем с
низкой аффинностью очень важна геометрия колонки. Для разделения
специфически адсорбированных белков от неадсорбированных наиболее выгодно
использовать длинные колонки, а не короткие.
Конечно, аффинный сорбент с высокой концентрацией лиганда является
нежелательным во всех случаях. На рис. 5.9 показана аффинная
хроматография рецептора ацетилхолина из электрического органа Torpedo
californica [30] на сефарозе, содержащей 2-10_3 (рис. 5.9, а) и 0,4-10-3
моль/л (рис. 5.9,6) NH(CH2)5CONH(CH2)3N+(CH3)3. Очевидно, что при
уменьшении концентрации слабый, неспецифический ионообменник превращается
в аффинный сорбент с высокой избирательностью. Последний был с успехом
применен для очистки больших количеств основного а-
бунгаротоксинсвязывающего компонента мембраны.
Снижение избирательности сорбента при выделении макромолекул после
превышения некоторой критической концентрации лиганда (когда сорбент
начинает действовать как нсспецифический ионообменник) впервые описано
