Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
согласуются. Более того, они совпадают также с константой диссоциации
комплекса антилизина с химотрипсином (9,8- 1(К6 моль/л), найденной по
кинетическим данным по Диксону [5]. Из тех же кинетических данных для
субстрата я-нитрофенилового эфира N-бензилоксикарбонил-l -тирозина была
определена константа Михаэлиса, значение которой 3,2-Ю-5 моль/л хорошо
согласуется со значением 3-10-5 моль/л, определенным другим методом [16].
4.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ ДИССОЦИАЦИИ ПО ДАННЫМ ФРОНТАЛЬНОГО АНАЛИЗА
Разновидность количественной аффинной хроматографии - фронтальный анализ
[10]; он основан на понятии плотности L0 аффинного лиганда на единицу
длины колонки с агарозой. Если I - общая длина колонки с агарозой, a Lt -
общее количество иммобилизованного лиганда в сорбенте, то Z.0=?.;//. Если
аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в
концентрации [Е0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования
фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение:
(V-/0) [?0] -I [ELJ, (4.6)
где Vo - объем элюирования при отсутствии взаимодействия между активным
центром фермента и иммобилизованным аффинным лигандом (например, в
присутствии растворимого сильного конкурентного ингибитора), а [EL]-
плотность комплекса фермент- иммобилизованный лиганд на единицу длины
колонки с агарозой. При комплекеообразовании достигается равновесие
k
Е -f- L <*' > EL
4*
52
Глава 4
Если концентрация свободного фермента [Е] = [?0], можно написать
следующее уравнение:
" ?¦_,____ [Е] [L] /l _ [?0] (1U ~ [ELI) fL
Ль А+1 - |HL]/el [ELJ/el
=(У-~Уо)/el '[La] [?о1'TST =<v- йыL ' [?о,'^Г' (4'7)
где Kl- константа диссоциации комплекса фермент - иммобилизованный
лиганд, [L]- плотность незанятого лиганда на единицу длины и /-
коэффициент активности реагента, подвижность которого ограничена. Если
хроматография проводится в условиях, когда [,Е0]</(+ уравнение (4.7)
можно переписать:
KL^L,fJ(V-V0)fEl, (4.8)
Если фермент элюируется в различных условиях [(1) и (2)] объемами Vi и
Уг, то
*мп _ {У* ~ Ео) и оч
*l,*> ~ (У, - к") '
где К по н Л'ш) - соответствующие константы диссоциации. Следовательно,
уравнение (4.9) применимо также для сопоставления различных ферментов.
Если фермент, элюируется объемом У,- в присутствии конкурентного
ингибитора в концентрации [/0] (когда [/о]>[?о]), то можно вывести
следующее уравнение:
WKb-l + IA.l/Ki^tV-yoMy.-Vo). (4-10>
где Ki - константа диссоциации комплекса фермент - растворимый ингибитор,
определяемая соотношением
", = i§(fL. H-Ч)
Согласно определению, /(l<и является наблюдаемой константой диссоциации
комплекса фермент - иммобилизованный лиганд в присутствии растворимого
ингибитора:
Klo) ="Е1 + |ЕШ [L! /J /|Е1] (4.12)
Уравнение (4.10) можно переписать:
(У - V,)/(V- У0) = 1/(1 + /С,/1/0)). (4.13)
Откуда следует, что (У-У,*)/(У-Уо) равно отношению концентрации комплекса
фермент - растворимый ингибитор к общей концентрации фермента.
Концентрация ингибитора, при которой (У- Vf)!(У- Уо) =0,5, равна Кi.
Уравнение (4.13) можно записать в другой форме:
Vt-=y0+ /С, <У-К,)/1/01. (4,14)
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 53
Если построить график зависимости Vi от (Е- 1Л)/[/о], то К\ и можно
рассчитать исходя из тангенса угла наклона и отрезка; отсекаемого на оси
ординат. Если V0 и V известны, то К\ для любого конкурентного ингибитора
можно получить из одного хроматографического опыта в присутствии
соответствующего ингибитора.
•Э - ------------------------------ -
Номер фракции
V- V,
-f-L- (ммоль/л)
'о
Рис, 4,4. Хроматография бычьего трипсина на глицилгликил-ь-арпшии-
сефарозе
{180X6 мм, 5,1 мл) [10].
а - зависимость от концентрации (ммоль/л) бензоксикарбоннларгииииа в 0,1
трис-малеатном буферном растворе (pH 6,2), Бычин fi-трипсин наносился в
колонку а вице соответствующих растворов в том же буфере ( - 10 мкг/мл,
т. е. 5* ]О-7 моль/л) непрерывно. Скорость потока 3 нл'ч, объем фракций U
мл. Хроматография проводилась в холодной комнате (4РС). Элюирование
фермента определялось по ферментативной активности с п иитроаннлидом беи
эонл ОХ-аргинниа в качестве субстрата. За объем элюирования принимался
объем, в кото ром концентрация выходящего фермента достигала половины
высоты плато; б - зависимость У^от (V-V#)//*
На рис. 4.4, а приведены данные по хроматографическому поведению бычьего
трипсина на сефарозе с ковалентно связанным глицилглнцил- L-аргинином
(2,2 мкмоль пептида на 1 мл сефаро-зы). Ка аффинный сорбент,
уравновешенный данными концентрациями ингибитора
(бензилоксикарбониларгинина) всегда наносился раствор трипсина,
содержащий ингибитор в соответствующей концентрации. График зависимости
Vi от (V-К;)/[/о] (рис. 4.4, б) представляет собой прямую, что
подтверждает справедливость выведенного уравнения. Из тангенса угла
наклона и отрезка, отсекаемого на оси ординат, получены /Сг = 0,29
ммоль/л и Ко =11,6 мл. Для бензилоксикарбониларгинина Ки определенная
