Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
151, 631-636
(1975).
3. Chaiken I. М., Taylor И. C., J. Biol. Chem., 251, 2044-2048 (1976).
4. Craven D. B., Harvey M. /,, Lowe C. R., Dean P. D. GEur, J.
Biochem.,
41, 329-333 (1974).
5. Dixon At., Biochem. J., 55. 170-171 (195 11
6. Dunn В. М., Chaiken 1. М., Proc. Nat Acad- Set U.S., 71, 2382-2385
(1974).
7. Dunn B. At, Chaiken /. M.t Biochemistry, 14, 2343-2349 (1975).
8. Gawronski Т. H., Wold F" Biochemistry, II, 442-448 (1972).
9. Harvey At. J., Lowe C. P., Craven D. B., Dean P. D. G., Eur. J.
Biochem., 41, 335- 340 (1974).
10. Kasai K-, Ishii S., J. Biochem. (Tokyo), 77, 261-264 (1975).
11. Lowe C. R., Harvey М. I., Dean P. D. G., Eur. J. Biochem., 42, 1-6
(1974).
12. Nichol L. W., Ogston A. GWinzor D. J., Sawyer W. H., Biochem. J.,
143, 435-443 (1974).
13. Okada S., Husitni Y., Tanabe S., Wada A., Biopolymcrs, 14, 33-49
(1975),
14. Schott H., Eckstein H., Gatjield L, Bayer E., Biochemistry, 14, 5541-
5548
(1975).
15. Turkova J., Stranska At.. Bldha K, Coupek I., unpublished work.
16. Walsh K. A., Wilcox P. E., Methods Enzymoh, 19, 31-41 (1970).
Глава 5
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
Связывание мономерного аффинанта, например ингибитора I с ферментом Е,
характеризуется константой равновесия К\ в предположении, что фермент
существует в единственной третичной конформации:
E + I EI
kt
(5.1)
Привязка аффинанта к нерастворимому носителю в определенной мере
сказывается на константе равновесия Ки Увеличение Ki обусловлено
модификацией аффинанта связыванием с матрицей, следствием чего является
ограничение стерической доступности аффинанта. Напротив, уменьшение Ki
вызывается неспецифической сорбцией фермента на нерастворимом носителе и
на уже сорбированном ферменте. Если предположить, что в неочищенном
препарате белка только один фермент имеет сродство к матрице, равновесие
между привязанным аффинантом и выделяемым ферментом можно выразить
следующим образом:
Ч
Е + L +==* EL
ч
&GL=-KTlnKL. (5.2)
Для успешного выделения фермента с помощью аффинной хроматографии
необходимы очень низкие значения Kt или Kl- Обе константы должны быть
много меньше, чем любая константа диссоциации для неспецифической сорбции
белка на поверхности матрицы. Максимум для Kl может быть оценен следующим
образом, Исходя из концентрации ингибитора в нерастворимом аф финанте,
равной 1(Е3 моль/л, и требования 99%-ного связывания фермента при
хроматографии неочищенного материала, содержа щего Ю-5 моль/л фермента в
объеме, равном тройному объему нерастворимого аффинанта, в качестве
верхнего предела для К\ получают значение 10-4 моль/л. В 3%-ном растворе
белка, содержащем активный фермент с молекулярной массой 10(r) в количестве
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
63
10% от всего белка, в указанных выше условиях используется ~10% емкости
матрицы.
Отсюда следует, что, поскольку между ин1-ибитором и ферментом образуется
связь, в целом процесс очистки следует рассматривать скорее как
осаждение, а не как хроматографию. Это может быть продемонстрировано
изотермой адсорбции для аффинной хроматографии, приведенной на рис. 5.1:
суммарная изотерма
адсорбции (.3) может быть определена как сумма изотерм специфической (/)
и неспецифической (2) адсорбции. Специфическая изотерма адсорбции
характеризует идеальную специфическую сорбцию с постоянной и относительно
высокой адсорбционной энергией AG для всех адсорбируемых частиц. Сорбция
прекращается, когда все доступные "аффинантные" центры заняты.
Изотерма неспецифической адсорбции характеризует сорбцию белков на
неспецифических участках матрицы и на молекулах уже сорбированного белка.
Величина AGL складывается из AGi и AGHecneu. ГД? ДСнеспец - энергия
реакции неспецифичеекого комплексообразования и вклад пространственных
ограничений. Если для Ki принять среднее значение Ю-5 моль/л, то AG,&7
ккал/моль.
Адсорбционная энергия для неспецифической сорбции Абнеспец складывается
из энергии гидрофобных, гидрофильных или даже ионных взаимодействий и
сопоставима с адсорбционной энергией в обычной хроматографии. Она очень
сильно зависит от природы нерастворимого носителя и белка. AGHPCneu
должна быть по возможности низкой, потому что она включает также сорбцию
молекул, которые образуют неспецифические комплексы с аффи-нантом.
Однако иногда в неочищенном белке содержатся два или более фермента,
обнаруживающих сродство к связанному аффинанту. Если константа равновесия
реакции для второго фермента /С: (II) > 10~3 моль/л, то только
незначительные количества второго фермента будут задерживаться на
носителе вместе с выделяемым ферментом. Если Ai (II) ^ Ю-4 моль/л, то
собируется смесь обоих ферментов даже в том случае, если К\ выделяемого
фермента много меньше /Ci {11) - Это следует из специфической формы
изотермы адсорбции для аффинной хроматографии, поскольку теплота
адсорбции предельно высока в условиях хроматографии.
Рис. 5.1. Изотерма адсорбции для аффинной хроматографии.
