Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
(1963).
10. Nishikawa A. H , Bailon P., Ramel A. If., Advan, Exp, Med. Biol., 42,
33- 42 (1974). 4
11. Okada S., Htisimi Y., Tanabe S.. Wada A., Biopolymers, 14, 33-49
(1975).
12. Porath I.. Methods Enzymol., 34, 13-30 (1974).
13. Porath J" Kristiansen Т., in: The Proteins, H. Neurath, R. L. Hill
(Eds.), Academic Press, New York, 3rd ed., 1975, pp. 95-178,
14. Reiner R. H., Walch A., Chromatographia, 4, 578-587 (1971).
15. Steers E., Cuatrecasas PPollard H. B., J. Biol. Chem.. 246. 196-200
(1971).
16. Turkovd I., Bldha K., Valentova O., Coupek J., Seifertova A.,
Biochim. Biophys. Acta, 427, 586-593 (1976).
Глава 4
Применение аффинной хроматографии для количественной оценки
специфического комплексообразования
Процессы ассоциации без сомнения играют одну из наиболее важных ролей в
биохимии. Начальная степень связывания субстрата оказывает значительное
влияние на каталитические свойства фермента. Контролируемые процессы в
биологии зависят от ассоциации репрессора с опероном, гормонов со
специфическими рецепторами и т. п. Важную роль играют специфические
комплексы цепей нуклеиновых кислот или антител с антигенами. Методы
прямого определения взаимодействий лиганд--белок, такие, как равновесный
диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация, спектроскопические методы и
анализ стационарной кинетики, в настоящее время дополнились определением
констант диссоциации, основанным на аффинной хроматографии [1-3, 6-8, 10-
-12].' Применение аффинной хроматографии для изучения взаимодействий в
биологических комплексах кажется весьма обещающим. Однако в настоящее
время из немногих работ, количественно описывающих взаимодействия по
результатам аффинной хроматографии, нельзя сделать никаких обобщающих
выводов. В данной главе детально описывается определение констант
диссоциации комплексов нуклеазы с ее ингибиторами по данным элюирования,
а также использование этих же данных для определения констант диссоциации
комплексов химотрипсина с синтетическими низкомолекулярными и с
природными высокомолекулярными ингибиторами (разд. 4.1). Далее
рассматривается определение констант диссоциации комплексов трипсина с
низкомолекулярными ингибиторами по данным фронтального анализа (разд.
4.2). В разд. 4.3 обсуждается кооперативное элюирование олигоадениловой
кислоты при ее хроматографии на иммобилизованной полиуридиловой кислоте.
В заключение главы описывается прямое титрование белка S-рибонуклеазы S-
пептидом, определение силы связывания дегидрогеназ и нуклеотидов,
основанное на данных о концентрации хлорида калия, необходимой для
элюирования, и взаимодействия связанных нуклеотидов и пептидов по
отношению объемов элюирования последних.
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 45
4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ ДИССОЦИАЦИИ ПО ДАННЫМ ЭЛЮИРОВАНИЯ
Наиболее часто используемый метод количественной аффинной хроматографии
основан на элюировании биологических макромолекул с аффинной матрицы
растворами аффинантов в различных концентрациях [7].
Объем элюирования макромолекулярного вещества прямо пропорционален
концентрации аффинного лиганда, связанного с нерастворимым носителем,
если концентрация растворимого аффинного лиганда постоянна. Кроме того,
он обратно пропорционален концентрации растворимого аффинанта, если
концентрация иммобилизованного аффинанта постоянна. Эти зависимости
выражаются уравнением
где V - объем элюирования; У0 - объем элюирования макромолекулярного
соединения при отсутствии взаимодействий с иммобилизованным лигандом
(например, с ферментом в присутствии сильного ингибитора); Vm - свободный
объем, определяемый, например, при элюировании голубого декстрана; [L] -
концентрация иммобилизованного лиганда, определяемая на основании
операционной емкости сорбента; Кь--константа диссоциации комплекса
макромолекулярного соединения с иммобилизованным лигандом; [1] -
концентрация растворимого аффинного лиганда, К\ - константа диссоциации
бинарного комплекса в растворе.
Справедливость этого уравнения проверена Данном и Чейке-ном [7] при
исследовании хроматографического поведения стафилококковой нуклеазы на
тимидин-3/-("-сефароза-аминофекилфос-фат)-5'-фосфате (pdTpAP-сефарозе) от
концентрации как иммобилизованного нуклеотида, так и растворимого
нуклеотида, использованных для элюирования нуклеазы.
На рис. 4.1 показано влияние разбавления аффинной матрицы незамещенной
сефарозой. Во всех опытах, отличающихся только концентрацией
иммобилизованного тимидин-3'-(я-аминофенилфос-фат)-5/-фосфата (pdTpAP),
раствором ингибитора тимидин-З'Д'-бисфосфата (pdTp) из колонок pdTpAP-
сефарозы элюируется одинаковое количество нуклеазы. Объем элюирования
нуклеазы прямо пропорционален концентрации иммобилизованного нуклеотида
(рис. 4.1,6). Приведенная зависимость согласуется с уравнением (4.1).
Полученное при экстраполяции зависимости V от [L] к [L]=0 значение V0
очень хорошо согласуется с экспериментальным, которое найдено при
