Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
количества фермента, остающегося связанным после п промывок, Грейвс и By
[3] получили выражение:
Связанный фермент , ^_____________Lav (K\J> + Laи)" , е.
Весь фермент 'Вп [KL (V + v) -j- L0v] [Kl(^ + Ф + ?>о"]п ' '
Для фракции фермента, остающейся связанной после стадии элюирования,
выведено уравнение:
t____________________i0t> (KLv + V)n+l____________________ lg.
Е ~ [Ль (V + v) + VI [K'l (Г + v) -р V| [XL (ш + в) + V]" '
Исходя из уравнений (3.8) и (3.12), было получено выражение для
количества фермента, содержащегося в элюате:
Выделенный фермент Весь фермент
=А? ~ ("i?' + v ) ^ ~ fuE - 2 A j ¦ (3.17)
где - фракция фермента (отнесенная к его исходному количеству), которая
теряется с отбрасываемым объемом V. Фракции /; выражаются через
относительно простые соотношения:
Ь^{т+г)( 1 - KL(V + v)-\ L0v )> <3'18>
A~(^r)(i~An'U (зл9>
(3-20)
Выражение для каждой последующей фракции постепенно усложняется,
поскольку в нее входит предыдущее уравнение. Следовательно, для
отнесенной к исходному количеству фермента Фракций fn, которая теряется в
отбрасываемых после п промывок объемах ш, справедливо следующее
уравнение:
Г\т' / - и У
2.J (л - 1 - ()Ш ^ w -\- v j
Л-1
-2 л
;-i
?=0
/ ... ?4-1 1
(3.21)
J, (п - 1 - }')! / -И) \
Zi (а - 1 - i - /)!/I \ w + v ) /-0
30
Глава 3
С увеличением числа промывок фактор очистки Pf также значительно
возрастает, Например, если каждая единичная промывка имеет относительно
большой объем (ш/о = 10), Pf возрастает с 2 до 22. Уменьшение процента
выхода фермента при этом зависит также от Kl. Например, для iCL == 10-5
моль/л выход фермента снижается незначительно, но для Kl=10-4 моль/л
выход при высоких величинах KL уменьшается с 90 до 82%, а для Kl = = 10~3
моль/л он понижается уже с 83 до 44%. На рис. 3.5,6 показана зависимость
процента выхода фермента от KL после 10-кратной промывки при w/v - 1. Для
Kl=10 5 моль/л достигается очень высокая степень очистки (Р/ = 2000) при
относительно большом выходе фермента.
3.1.3. Равновесная модель для элюирования конкурентным ингибитором
Другим наиболее часто применяемым методом освобождения фермента из его
комплекса со связанным лигандом является элюн рование фермента раствором
конкурентного ингибитора. При это> основное требование состоит в
сохранении значения Kl в ход-процесса элюирования. Уравнения (3.1) и
(3.2), описывающж равновесие между ферментом и связанным аффинным
лигандом, необходимо дополнить:
Е -1-1 EI (3.22)
И
*'=ТГ-ТЭД-- <3-23)
Последние уравнения относятся к образованию комплекса между ферментом и
растворимым ингибитором. Все используемые далее символы имеют те же
значения, что и раньше, однако V теперь означает объем раствора
ингибитора. Кроме того, вводятся новые обозначения: h - начальная
концентрация ингибитора, [I]-конечная концентрация ингибитора, [EI]-
равновесная концентрация фермента, находящегося в комплексе в растворе, и
vEl - число молей фермента, присутствующего в геле до добавления раствора
ингибитора. Более того, полученные ранее соотношения, характеризующие
эффективность промывок, можно применить также при анализе данного метода
элюирования.
Для связанного и включенного в гель (остающегося в геле после п промывок)
фермента справедливо следующее выражение:
+ <3'24)
Теория аффинной хроматографии
31
где fen может быть получено из уравнения (3.15), а /; - из уравнения
(3.18) через уравнения (3.20) и (3.21).
Комбинируя уравнения (3.2) и (3.23) и используя уравнение материального
баланса, Грейвс и By [3] сделали возможные упрощения и вывели для
равновесной концентрации комплекса фермента с растворимым ингибитором
следующее выражение:
IEI1 ~___________________________________^----------------------------
~ v(V' + v) (2-Kj/Kl) El + V' (V + V)I0+ Kl (V' + ч)2 + KiL0v (Г'+Ф/Аф"
(3.25)
Логически следует (и даже может быть доказано), что в присутствии двух
ингибиторов, одного в растворе, а другого в виде иммобилизованного
аффинного лиганда, в равновесии находится только небольшое количество
свободного фермента [Е], хотя общее содержание фермента в растворе может
быть значительным (в виде [Н1 ]). В большинстве случаев общее количество
фермента в растворе можно без большой ошибки выразить как У'[Е1] вместо
1/'([Е1] + [Е]). При таком упрощении, используя уравнение (3.25), а также
введя p=V'fv, Грейвс и By вывели следующее уравнение для доли полученного
фермента:
Выделенный фермент V' [Е1]
Весь фермент в промытом геле c?L __________________________ р/0__________
Р + 1
2?ь + Р/о + Kl (1 + Р) +(Ц - ?l>
(3.26)
Как показано ранее, обычно L0^El, и, следовательно, Г' f Е Г ] / р \ Г
р/"
vE L
( Р + 1 ) [ Р'о + *i <1+° Р + ц/ко ¦ <3-27)
Для упрощения уравнения (3.27) полезно рассмотреть в качестве первого
приближения случай, когда Lo/Kt^p, и членом Лз(1 + р) поэтому можно
пренебречь. В реальных случаях наибольшие значения для р равны ~ 10
(более высокие значения соответствуют излишнему разбавлению выделяемого
