Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
Если механизм превращения ES в продукт более сложен, в частности многостадиен, константу к+2 заменяют константой реакции первого порядка ккат. * *:
Более точной мерой эффективности в условиях, приближающихся к реальным, даёт бимолекулярная константа скорости к+г/Кщ- Подставляя в это выражение Km == (k-i + k+г)A+i, получим
214
• j ,» k»ak»i k*2 4 k-i
Анализируя это выражение, можно видеть, что его величина существенно зависит ср величины к+ь т.е. от скорости образования комплекса Михаэлиса, а последняя имеет свой предел, определяемый скоростью диффузии частиц в‘растворе, и не может превышать числа столкновений субстрата и фермента. Действительно, известны ферменты, например карбангидраза и ацетилхолинэстераза, для, которых величина ккдтАт близка к пределу и ограничивается только частотой столкновений фермента и субстрата.
' 10.4. ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ ,
> ¦ • . Г , ‘ . i ¦ ’ - '- * ' ч ’ 1 ;
Ингибирование, т.е. полное или частичное подавление активности ферментов при сохранении их первичной и пространственной структура, — один из важнейших путей регуляций биохимических процессов и в то же время продуктивный способ изучения биокатализа. Различают обратимые и необратимые ингибиторы.
К необратимым относят такие ингибиторы^ которые инактивируют фермент, образуя с вий связь, Достаточно устойчивую и'практически не диссоциирующую в условиях, типичных для его действия. Обычно это ковалентная связь с одной йз функциональных групп каталитического центра.
* Заметим, что нередко удается подобрать такие условия, при которых : инактивирующая группировка отщепляется и фермент реактивируется, однако поскольку эти условия принципиально отличны от тех, при которых происходило ингибирование, последнее все же считается .необратимым.
Для примера рассмотрим ингибирование протеолитического фермента папаина, имеющего в каталитическом центре тиоловую группу цистеина, ^соединениями ртути. Реакция иона двухвалентной ртути с этой тиоловой группой приводит к образованию трудно диссоциирующего меркалтида:
Пап*ии*-СН2“"$Н + Hg2+ —> Папаин-СН2~S-Hg+
'I
*1 »’ .»»’**» ’ • L • '
Фермент утрачивает в результате этой реакции активность, и ингибирование в данных условиях нербратимо. Однако в присутствии избытка других тиоловых соединений, например меркаптоэтанола, происходит перераспределение ионов ртути между ними и цистеином в
215
активном центре папаина, вследствие чего последний высвобождается
г
и папаин полностью восстанавливает свою активность:
Папаин-CH2S~Hg+ + HSCH2CH20H —> Папаин-СН^Н + +Hg-SCH2CH20H
* ¦ i. . *
Такую последовательность превращений использую* на практике как способ хранения папаина, предотвращающий егб саморасщепле-ние, автолиз. .Тем не менее ингибирование ’папаин&с ионами ртути рассматривают как необратимое.
- С возможностью действия необратимых ингибиторов следует считаться, в частности, при выделении ферментов. Так; ионы ртути, свинца, меди и ряда других тяжелых металлов, блокируя сульфгидриль-ные группы некоторых ферментов, могут их инактивировать, что требует тщательного их удаления из растворов, а иногда применения комплексонов. ¦
*
¦ Среди необратимых ингибиторов выделяются специфические реагенты на функциональные группы каталитического центра ферментов. Избирательность их действия повышается, если они содержат структуры, способствующие их- связыванию в активном Центре или, что еще эффективнее, воспроизводят строение переходного фермент-субстрат-ного комплекса. Например, при действии диизопропилфторфосфата на трипсин или другие сериновые протеин азы ингибитор ацилйрует активную гидроксильную группу серина в активном центре фермента, однако образующееся соединение, будучи структурным аналогом переходного состояния, устойчиво к дальнейшему гидролизу, поэтому фермент не может регенерироваться и оказывается необратимо ингибированным. Диизопропилфторфосфат необратимо ингибирует также холинэстеразы, что делает его сильным ядом.
Необратимое ингибирование встречается и в природе- Именно так пёнициллины инактивируют D ,Б-карбоксипептидазу — фермент, вовлеченный в биосинтез муреина — полимера, который входит в структуру стенок бактериальных клеток. Пенициллины, в известной мере имитирующие строение субстрата этого фермента, ^яязываются с нимки ацшщруют с раскрытием ^-лактамного цикла гидроксильную, .группу серина в активном центре фермента, что вызывает его необратимое ингибирование. и ¦ <
Взаимодействие обратимых ингибиторов с ферментом по схеме
е+д^=±б1
, ; • . . . i ¦*> * * описывается константой ингибирования К|, которая представляет (обой константу диссоциации комплекса фермент—ингибитор EI: > . ,
Очевидно, что Kj численно равна концентрации ингибитора, при которой половика молекул фермента оказывается связанной в комплекс фермент—ингибитор.
