Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
I-J"L 1 , 1
V Vmax Т§Т Vmax
В такой форме уравнение Михаэлиса—Ментен эквивалентно уравнению прямой вида у = ах + Ь, где у = 1/V, х = 1/S,
1
a-Jk. 6-J-
а — 1/ » ° —' v 1
'max - ’max
т.е. описывает прямую, отсекающую отрезки на координатных осях (рис. 10.2). Бели при возрастании концентрации субстрата до очень высоких значений 1/[S] стремится к нулю, то 1/V оказывается равным 1/Vmax- Таким образом, измерив отрезок, отсекаемый прямой на оси 1/V, можно вычислить Vmax- Если же 1/V равно нулю, то
____1____Km 1
Vmax Vmax [S]
и Кщ оказывается равной - [S].
212
Известны и другие, в том числе и более удобные для Обработки данных, преобразования уравнения Михазлиса—
Ментен, использование которых рписано в .специальных руководствах. В последнее время расчеты на ЭВМ вытесняют графические методы.
Применение уравнения Ми-хаэлиса—Ментен позволяет
количественно. характеризовать эффективность действия ферментов, сравнивать их действие на разл^ичнре субстраты. Как уже говорилось, значение Кт с определенными оговорками
позволяет Оценить сродство различных фермектов к их субстратам. Величины km лежат в весьма широком интервале концентраций, обычно начинаясь с миллимолярных. Встречаются и значительно большие значения что может быть связано с использованием субстратов, не вполне отвечающих специфичности фермента. Понятно, что для небольших субстратов, например HCOjj нелегко организовать достаточно
развитую систему взаимодействия с ферментом, поэтому величины Кт, вероятно, будут высокими.
Константы Михаэлиса становятся значительно ниже, связывание —¦ эффективнее, если субстрат является протяженным и с ним возможно' установление большого числа нековалентных контактов. Так, панкреатическая эластаза (фермент, природными субстратами которого являются белки или пептиды) весьма слабо связывает простейший модельный субстрат — метиловый эфир ацетил-Ь-аланина. Кщ составляет в этом случае 170 мМ. С удлиненней пептидной цепи Кт быстро понижается, связывание улучшается. Так, для метилового эфира ацетил-ала-нил-аланина Кщ равна 22 мМ, для метилового эфира ацетил*«ланил— аланил-аланина — 0,4 мМ.
Впрочем, не следует думать, что в процессе эволюции ¦ ферментов действуют факторы, направленные на постоянное поннжецие Кт и улучшение связывания субстратов. Пснвидимому, достигается оптимальное связывание, характерное для каждой пары фермент—субстрат. В клетке субстраты многих ферментов содержатся в концентрациях,
Рис. 10.2. Зависимость величины, обратной скорости реакции 1 /V (время, затрачиваемое на превращение единицы вещества), от величины, обратной концентрации субстрата 1/[S] (разведение):
отрезок, отсекаемый на оси зг,
V Ущах ~ отрезок, отсекаемый на оси у
\ '
213
существенно меньших Km, а следовательно, ферменты не работают в режиме насыщения. Таким образом, для природных систем типична ситуация, когда скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата и повышение последней не требует непременно усиления биосинтеза фермента. • ':>'-
А.Фершт и сотрудники, изучая свойства тирозил-РНК~синтетазы, обратили внимание на то, что Кт для одного из субстратов — АТР — равна 2,5 мМ, что на несколько порядков выше констант диссоциации, известных для комплексов АТР с другими белками. Так, Кт мйозина по АТР равна 10"10 мМ. Совершенно очевидно, что прочное, связыва-ние такой крупной молекулы, как аденозинтрифосфат, ^способной образовывать целую сеть нековалентных связей с белком, вполне осуществимо.' Эта возможность не реализована в тирозцл-тР НК-синтетазе не потому, что фермент несовершенен. Видимо, прочное связывание АТР с участием большого числа фермент-субстратных контактов привело 6iii к жесткой системе, в которой перемещения субстрата ртнрси-тельно каталитического центра были бы крайне затруднены, что снизило бы эффективность катализа. К тому же такое' "совершенство" излишне, поскольку внутриклеточная концентрация АТР близка к 2—3 мМ, а значит, "идеальный" фермент с лучшим связыванием вряд лй получил бы серьезный выигрыш за счет снижения Кщ.
Важной характеристикой эффективности действия фермента является константа к*2, описывающая распад фермент-субстратного комплекса с образованием продукта реакции. Как было показано выше, Vmax = k+2 [E^J. Зная общую концентрацию [E^J (для этого необходимо не просто знать концентрацию белкк в растборе, а определить, пользуясь специально разработанными методами, концентрацию активных центров), можно рассчитать число молекул субстрату превращающихся в продукт за единицу времени (1 с) при полном насыщении фермента субстратом. Эта величина, которую называют число 'оборотов; весьма различна у разных ‘ферментов. Так, для карбангидразы она ‘равна 60 ООО, для лизоцима — Всего лишь 0,5-. Следует подчеркнуть, что число оборотов характеризует максимально возможную скорость работы фермента, но не его эффективность .в реальных условиях; когда насыщения субстратом нет.
