Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
в случае аргинина — и карбоксилат-анионом остатка
аспарагиновой кислоты, расположенного на дне гидрофобной впадины Si (Asp-189в трипсине) (рис, 10.3). Такому электростатическому взаимодействию .благоприятствует изоляция ионной пары от контакта с водой. ,< ;-i -
Кроме того,- оно дополняется системой водородных связей между гуанидо- или аминогруппой субстрата и карбоксилат-ионом Asp-189, а также кислородными атомами ряда С=0-групп фермента. Замена остатка Asp-189 на остаток лизина в трипсине, проведенная методами белковой инженерии,' радикально изменила специфичность фермента, который перестал гидролизовать пептидные связи аргинина и лизина, но приобрел (правда, .слабую) способность расщеплять связи, образованные гидрофобными остатками фенилаланина, лейцина, тирозина, • т.е. по специфичности стал близким другому ферменту того же семейства — химотрипсину.
223
Рис. 10.3. Размещение боковой цепи остатка Pj субстрата в зоне Si трипсина. А - взаимодействия ГШ^-группы лизина, Б - гуанидогруппы аргинина:
»
полыми кружками обозначены атомы кислорода, зачерненными - азота,1W - молекулы воды, удерживаемые ферментом; пунктиром показаны водородные связи, цифрами -их длина в. ангстремах
Иногда остаток Pi не столь доминирует в определении сдецифич-ности, и больший вес приобретают взаимодействия с ферментом других аминокислотных остатков субстрата. Например, специфичность калликреина — аналога трипсина, вовлеченного в регуляторные механизмы у животных, — определяется присутствием аргинина в положении Pi и'гидрофобного остатка в положении Р2 субстрата и оказывается, таким образом, гораздо более узкой.
При действии протеиназ на нативные белковые субстраты специфичность гидролиза определяется не только и даже не столько последовательностью аминокислот расщепляемого участка, сколько его пространственной, стерической доступностью. Так, погружение всего активного ценТра калликреина в своего рода впадину за счет удлинения прилегающих к нему пептидцых петель фермента делает практически невозможным гидролиз обычных белковых субстратов, даже если они содержат последовательность гидрофобный остаток -г- арги-ниш Кадликреид атакует только, такой белок, в котором соответствующая его специфичности последовательность расположена на выступе белка-субстрата, комплементарном впадине активного центра фермента. Так.достигается очень узкая, практически уникальная специфичность калликреина — фермента, участвующего в отщеплении вазоактивных пептидов от белковых, предшественников, но практически не действующего «а другие белки. ., ,
Отметим еще одну особенность связывания белковых субстратов в активном центре протеиназ. При образовании комплексов с достаточно 224
длинными пептидами, перекрывающими активный центр, укладка щолипептидной цепи в зоне связывания требует, как предполагают, (определенного ее "перекручивания", некоторого искажения плоскостной структуры атакуемой ферментом пептидной связи, что создает благоприятные условия для ее перехода из плоской в пирамидальную конфигурацию, .близкую к переходному состоянию. Следовательно, уже на стадии образования комплекса Михаэлиса при связывании ¦субстрата подготавливается стереохимический переход, имеющий ключевое значение для эффективного катализа.
Характерные для сериновых протеиназ черты связывания субстрата
— множественность взаимодействий, точность ориентации относительно групп каталитического центра и преимущественное связывание конформации, стереохимически приближенной к той, которая существует в переходном комплексе, — типичны для многих ферментов. Необходимо подчеркнуть, что две важнейшие стадии катализа — связывание субстрата и собственно каталитическое превращение, — хотя и рассматриваются . раздельно, в действительности слиты в единый механизм.
10.5.2. Каталитический механизм
i
Топография каталитического центра сериновых протеиназ описана достаточно подробно. Изучение структуры комплексов ферментов этого класса с различными аналогами субстратов и ингибиторами в сочетании с данными по кинетике катализа, химической модификации отдельных групп фермента, метода ЯМР и белковой инженерии привели к следующим представлениям о механизме действия 'сериновых протеиназ.
В превращении субстратов наибольшая роль принадлежит гидроксильной группе серина-195 (здесь и далее нумерация остатков дается по последовательности наиболее изученного фермента — а-химотрип-сина), имидазолу His-57, /^-карбоксильной группе Asp-102, а также пептидным4 группам остатков Ser-195 и Gly-193. Таким образом, в сериновых протеиназах, как и в других ферментах, активный центр собран из. аминокислотных остатков, расположенных в совершенно разных участках полипептидной цепи, но сближенных в пространственной структуре фермента (рис. 10.4).
Как правило, компоненты каталитического центра взаимодействуют с соседними группами фермента, что закрепляет их в определенной ориентации и видоизменяет химические характеристики. Например, •карбоксильная группа остатка Asp-102 образует с соседями четыре водородные связи, которые стабилизируют ее анионную форму и, как
