Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Еще одной причиной нарушения хроматографического процесса может быть неравномерная набивка колонки. Адсорбент фактически всегда состоит из частиц разных размеров; это значит, что при спокойном осаждении более крупные частицы ока-
Буфер
Адсорбент -
Пробка из стеклянной ваты
-¦/л:
№
Пористый диск
ft.
1
Буфер
Адсорбент
-Слой фильтрованной ткани
Стеклянная трубка
Рис. 1.9. Простейшие колонки: пастеровская пипетка (Л), шприц (?) и стеклянная трубка (?). Все они приспособлены для колоночной хроматографии.
Поверхность, забитая осадком
Небольшое
углубление
Рис. 1.10. Некоторые сложности, связанные с нанесением образца на колонку. А. Идеальная ситуация: жидкость равномерно распределяется по поверхности. Б. Из-за небольшой щели на боковой поверхности пористого аппликатора большая часть жидкости проходит через эту щель, что приводит к неравномерному распределению образца на поверхности адсорбента. В. Раствор, вытекающий по каплям из трубчатого аппликатора, выбивает в адсорбенте ямку, что приводит к избыточному току жидкости в центре колонки. Г. Чтобы избежать ситуации, изображенной на рис. В, над поверхностью адсорбента создают большой слой буфера. Д. Частицы, содержащиеся в образце, закупоривают поверхность адсорбента. В случае образования небольшой ямки на одной стороне поверхности адсорбента весь поток жидкости может проходить через нее и адсорбция будет неравномерной. Чтобы не допустить этого, образец следует отцентрифугировать или профильтровать перед нанесением на колонку.
24
Глава 1
жутся на дне, тогда как верхняя часть колонки в основном будет заполнена самыми мелкими частицами. Этот факт сам по себе не имеет особого значения, если не касаться вопроса о воспроизводимости. С другой стороны, взмучивание раствора во время осаждения может привести к неравномерному распределению частиц и, следовательно, будет причиной неравномерной набивки колонки, что повлечет за собой неравномерное протекание раствора во время работы.
В идеальном случае колонку следует заполнять адсорбентом за один прием при постоянном перемешивании суспензии, как показано на рис. 1.11. Короткие колонки удобно заполнять густой суспензией, в которой на 1 объем адсорбента приходится не более 1 объема буфера. При этом частицы быстро оседают благодаря тому, что жидкость свободно вытекает из колонки через открытую выходную трубку. После набивки колонки необходимо пропустить через нее несколько объемов буфера для уравновешивания; это особенно важно при работе с ионооб-менниками; в этом случае pH суспензии адсорбента в буфере должен быть доведен до нужной величины еще перед набивкой колонки.
Протекание жидкости через колонку может осуществляться под действием силы тяжести; если давление водяного столба высотой около 1 м не дает достаточно быстрого потока, значит, система, вероятно, частично блокирована или используемые трубки слишком тонки и создают большое сопротивление. Широко применяемые перистальтические насосы, с помощью которых можно поддерживать постоянную скорость протекания буфера, позволяют размещать образец, буфер и градиентный смеситель на удобном уровне.
Разделение белков .происходит на колонке, и результаты записываются по мере того, как жидкость вытекает из колонки. На рис. 1Л2 изображены также регистрирующий УФ-спектрофотометр, измеряющий оптическую плотность при длине волны 280 нм (полоса ^поглощения Тгр+Туг) или при длинах волн от 220 до 205 нм (полоса поглощения
Рис. 1.11. Идеальный метод заполнения колонки. Суспензия непрерывно перемешивается в резервуаре, находящемся над колонкой, с тем чтобы частицы разных размеров равномерен но распределялись по всей длине колонки.
Лаборатория очистки ферментов
25
пептидных групп), ,что обеспечивает большую чувствительность, и коллектор фракций, собирающий равные объемы жидкости за определенные промежутки времени. Если работать без перистальтического насоса, скорость потока может меняться; в этом случае для получения фракций равного объема более приемлем счет капель. С другой стороны, величина капель меняется вследствие изменения поверхностного натяжения по мере элюции белков. Поток с колонки можно разделить, с тем чтобы отбирать небольшое количество элюата -на ферментативный анализ. При правильной синхронизации можно записывать результаты определения ферментативной активности параллельно с кривой элюции белка. Градиентную элюцию можно осуществлять при помощи двух стаканов, соединенных сифоном. Более точные и воспроизводимые градиенты получаются при использовании
Рис. 1.12. Схема расположения всей системы для колоночной хроматографии, включая автоматический сбор элюата с помощью коллектора фракций и непрерывное измерение ферментативной активности.
26
Глава 1
двух цилиндров с лопастной мешалкой, соединенных между собой в нижней части (см. рис. 4.19). Наконец, любой градиент можно долучить с помощью автоматических систем типа «черного ящика».
