Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Грубые гомогенаты, содержащие органеллы или их фрагменты, можно фракционировать с помощью дифференциального' центрифугирования, при котором величина соЧ возрастает на. каждой ступени, и это приводит к последовательному осаждению частиц с постепенно уменьшающейся величиной г2 (р—р0) -Такое дифференциальное центрифугирование является первым этапом очистки органелл от различных тканей при условии, что» нужный фермент находится не в растворимой фракции, а в ор-ганеллах.
Современные центрифуги представляют собой надежные аппараты, сконструированные так, что они могут нормально* функционировать даже при некоторых нарушениях правил эксплуатации. В случае же серьезных неполадок они автоматически отключаются. Важнейшая неполадка — это неуравновешенный ротор. Причиной разбалансировки может быть разбившаяся во время центрифугирования пробирка или просто неточное* уравновешивание пробирок. Ясно, что уравновешенные пробирки нужно располагать в роторе одну против другой, или если*
Рис. 1.4. Расположение 2, 3, 4 и 6 пробирок в шестигнездном роторе центрифуги. При центрифугировании 4 и 6 пробирок нужно уравновешивать только пробирки, стоящие друг напротив друга (заштрихованы).
2
3
4(2 + 2)
6 (2 + 2 + 2)
2—1078
18
Глава 1
Ц_+ 20%
Вода
В
Рис. 1.5. Разные'способы уравновешивания раствора большой плотности в паре центрифужных пробирок. Л. При работе с небольшими объемами грубое уравновешивание массы пробирок достигается увеличением объема воды в одной из пробирок* Б. При работе с раствором большой плотности предпочтительнее по сравнению с А частичное заполнение обеих пробирок при условии, ¦что они сделаны из достаточно жесткого материала и не сжимаются при центрифугировании. В. Идеальное решение этой задачи состоит в заполнении обеих пробирок раствором большой плотности с использованием при необходимости вкладышей для данного ротора.
ротор шестигнездный (либо с большим числом гнезд, кратным трем), то три одинаково уравновешенные пробирки ставят так, как это показано на рис. 1.4.
Хотя небольшие пробирки можно уравновешивать по объему на глаз, объемы, превышающие 200 мл, следует взвешивать, чтобы избежать дисбаланса. Это относится, однако, только к тем случаям, когда в пробирках находится один и тот же раствор. Если же пробирку с образцом, содержащимся, например, в растворе сульфата аммония 80%-ного насыщения (плотность около 1,20), уравновешивают водой, то при этом потребуется очень большой объем воды (рис. 11.5). И это не совсем правильный способ уравновешивания, так как а) одинаковой должна быть инерция, а не масса раствора и б) по мере осаждения частиц в пробирке инерция возрастает. Лучше использовать две пробирки, заполненные менее чем наполовину (при условии, что пробирки сделаны из достаточно жесткого материала, выдерживающего заданную величину g), либо пробирки меньшего размера с адаптером, либо другой ротор. Центрифужные пробирки из полипропилена или поликарбоната достаточно прочны и могут быть использованы для разных целей. В некоторых случаях нужны стеклянные центрифужные пробирки, но пробирки из обычного стекла (Ругех) выдерживают только 3000—4000 g; специальные пробирки из прочного стекла (Со-гех) выдерживают до 15 000 g-.
В заключение необходимо сказать несколько слов о бережном обращении с центрифугами. Хотя биохимики редко используют кислоты или щелочи, обладающие высокой коррозионной активностью, они не всегда представляют себе, насколько
Лаборатория очистки ферментов
\9
коррозионноактивными могут быть простые соли. Роторы центрифуг, отлитые из сплавов алюминия, сильно корродируют при контакте металла с такими солями, как сульфат аммония. Сле-дует немедленно промыть центрифугу, если в нее попала какая-нибудь жидкость; лучше же всего мыть и протирать ротор центрифуги после каждого центрифугирования или по крайней мере каждый день. Загрязнение наружной поверхности центрифужных пробирок солевыми растворами (при погружении их для охлаждения в ледяную баню с солью) может быть причиной появления коррозионных пятен внутри ротора, если его не промывать достаточно часто. Следует также обратить внимание на то, что постоянная работа на центрифуге с максимальными скоростями приводит к более быстрому износу как ротора, так и мотора; в большинстве случаев при очистке ферментов достаточно половины этой скорости.
1.3. ПРИНЦИПЫ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Приемы работы с ионообменными колонками, методы гель-фильтрации и т. д. будут детально обсуждаться в гл. 4 и 5. В этом коротком введении даны лишь основные принципы и описано оборудование, используемое в колоночной хроматографии.
Хроматография основана на том, что растворенные вещества отстают от фронта растворителя по мере его продвижения по носителю. Название «хроматография» (от греч. chroma — цвет и grapho—пишу) было впервые использовано для описания разделения природных пигментов в результате разной степени их задержки на листе фильтровальной бумаги (рис. II.6). Этот принцип до сих пор широко используется и может быть назван одномерной хроматографией, так как лист бумаги практически не имеет толщины. Второе измерение появляется при использовании колонки с носителем, что может быть приравнено к стопке из многих полосок бумаги, как показано на рис. 1.6, В. Теперь образец на старте представляет собой диск или цилиндр, а не тонкую линию. По мере прохождения растворителя по колонке вещества, содержащиеся в образце, распределяются следующим образом. Вещества, полностью извлеченные растворителем, движутся вместе с фронтом растворителя (ф=1) и очень быстро вымываются. Вещества, полностью-адсорбированные носителем (/?/ = 0), останутся на старте.
