Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
10 мл можно сконцентрировать практически досуха, обсыпая диализный мешок порошком и периодически удаляя с его поверхности гидратированный гель. При работе с большими объемами можно использовать концентрированный раствор поли-этиленгликоля (например, 20%-ный). Диализный мешок оставляют в этом растворе при постоянном перемешивании на несколько часов. Метод можно считать вполне удовлетворительным при условии, что полимеры не содержат низкомолекулярных примесей, вредных для фермента.
Удаление солей; смена буферов
Концентрирование белковых растворов и диализ тесно связаны между собой. Обычно при диализе нежелательные низкомолекулярные вещества удаляются из образца и замещаются
Лаборатория очистки ферментов
29>
буфером. Осмотические силы действуют в противоположном направлении: под влиянием высокой концентрации соли или органических веществ, присутствующих в образце, вода начинает входить в диализный мешок раньше, чем соль выходит из-него; поэтому на первых этапах объем раствора в диализном мешке возрастает, если концентрация растворенных веществ высока. Диализ используют как для удаления избытка низкомолекулярных веществ, так и для одновременного введения нового' буферного раствора (а иногда н просто воды) в образец. В продаже имеются диализные трубки самых разных размеров;, обычно они не пропускают молекулы крупнее 15 000— 20 ООО дальтон. Все низкомолекулярные вещества свободно проходят через мембрану, и в результате состав буфера с обеих сторон уравнивается. Без смены буферного раствора, против, которого проводится диализ, невозможно полностью удалить, из образца эндогенные соли, так как равновесие, существовавшее изначально в диализном мешке, теперь устанавливается между содержимым диализного мешка и буферным раствором в диализате. Если объем буфера в 50 раз больше объема образца».
Таблица 1.1. Схемы проведения диализа для снижения концентрации соля от 1 М до менее чем 1 мМ‘>
Схема 1
Диализ против I л воды
—^увеличение объема до 100 мл; при
равновесии концентрация соли равна
95 мМ
Смена диализата, еще 1 л воды
—^увеличение объема до ЛЮ мл; при
равновесии концентрация соли равна 9,3 мМ
Смена диализата, еще 1 л воды
—^увеличения объема не происходит; при равновесии концентрация соли равна 0,9 мМ
Схема 2
Диализ против 5 л воды
—^увеличение объема до 110 мл; при
равновесии концентрация соли равна 20 мМ
Смена диализата, еще 5 л воды
—^-увеличения объема не происходит; при равновесии концентрация соли равна 0,4 мМ
Полное уравновешивание-достигается по меньшей мере за 3—5 ч, при менее продолжительном диализе необходимо четыре раза менять диализат
Достаточно одной сменьг диализата, даже* если полное уравновешивание' не достигается
') Образец представляет собой белок, растворенный в 50 мл буфера, содержащего 1 М сульфат аммония (растворенный осадок, полученный в результате фракционирован!!* сульфатом аммония).
30
Глава 1
I
Рис. 1.14. Применение диализного мешка. А. Наполнение образцом. Б. Перемешивание во время диализа. В. Разбухание за счет осмотического давления.
то в лучшем случае можно достигнуть 51-кратного разбавления исходного материала, содержащего соли и другие низкомолекулярные вещества. Следовательно, необходимо хотя бы один раз сменить буфер. Для ускорения процесса следует перемешивать буферный раствор и перемещать в нем диализный мешочек. В хорошо перемешиваемой системе уравновешивание более чем на 90% происходит за 2—3 ч. Лучше использовать большой объем буфера, так как при этом реже придется его менять (табл. 1.1). Если не требуется принимать особых предосторожностей, то диализ удобно проводить в течение ночи; к утру обычно достигается равновесие. Однако во время диализа может происходить протеолитическое расщепление белка (см. раздел 7.1), что ограничивает применение этого метода.
Лаборатория очистки ферментов
31l
Существуют способы предварительной обработки диализных, трубок для удаления из них различных химических веществ,, внесенных в процессе производства. Диализные трубки рекомендуется кипятить в растворе ЭДТА—NaHC03. Длительное хранение их в этом растворе также дает хороший результат. Проблема химического загрязнения белка возникает только тогда, когда нужно провести диализ очень разбавленного белкового раствора, так как в этом случае соотношение между площадью поверхности мембраны и количеством белка будет высоким. Белковые растворы с концентрацией порядка 10 мг-мл'1 и более при взаимодействии с мембраной, вероятно, не изменяются; на практике сухие диализные трубки можно спокойно использовать без какой-либо предварительной обработки. После увлажнения трубки на одном ее конце завязывают один или лучше два узла, а в другой конец вставляют воронку, через которую в мешок наливают раствор образца. Его удобно наливать, когда один конец диализного мешка лежит на какой-либо плоскости (рис. 1.14). Лучше всего перед тем, как наливать образец в мешок, положить его на плоскую поверхность так, чтобы через воронку не выходил воздух. Затем мешок завязывают с другого конца и помещают для диализа в буфер. В мешке необходимо оставить свободное пространство в расчете на увеличение объема, если концентрация растворенных в образце веществ высока. В противном случае при увеличении объема раствора мешок набухнет и давление внутри мешка сильно возрастет. Это может привести к разрыву мембраны или вытеканию раствора через узлы.
