Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
12
Глава 1
ствующее количеству образца. Наиболее пригодны для этой цели колонки с регулируемым плунжером (адаптером). Размеры колонок, используемых для удаления солей методом гель-фильтрации, описаны в разд. 1.4. Для адсорбционной хроматографии могут потребоваться колонки других размеров. Лучше приобрести две (или более) простые колонки, чем одну, приспособленную только для определенных целей.
Нужны также гомогенизаторы для разрушения клеток (они описаны в разд. 2.2). Такое обычное лабораторное оборудование, как весы, рН-метр, мешалки, аппараты для производства льда, необходимы при очистке ферментов так же, как и при использовании любой другой биохимической методики. Измерение объемов можно производить с помощью градуированных цилиндров (а в редких случаях, если необходима большая точность, мерных колб), пипеток и (для малых объемов) микро-литровых шприцев. При анализе ферментов часто требуется отмерить очень малый объем исследуемого раствора, например менее 1 мкл. Современные шприцы позволяют осуществлять добавление таких объемов с достаточной точностью. Желательно иметь шприцы объемом от 0,5 до 250 мкл. Кроме того, очень удобны регулируемые пипетки типа «Eppendorf» с набором наконечников объемом от 5 мкл до 5 мл.
Электрофоретический анализ смеси белков проводят с помощью гель-электрофореза или изоэлектрического фокусирования, чаще всего в полиакриламидном геле с додецилсульфатом в качестве денатурирующего агента или без него. Методика описывается в разд. 9.1. В настоящее время в продаже имеется много прекрасного оборудования; начинающим можно посоветовать сразу же приобрести прибор для тонкослойного электрофореза. Пожалуй, сейчас в мире мало найдется биохимических лабораторий, в которых не было бы оборудования для аналитического гель-электрофореза.
При очистке белка применяется целый ряд специальных реактивов. Это в основном адсорбенты для колоночной хроматографии и различные часто используемые химические вещества. В лаборатории должны быть ионообменники (разд. 4.3), все необходимое для гель-фильтрации (разд. 5.1) и аффинные адсорбенты (разд. 4.5). Очень важны и более обычные вещи, например трубки для диализа (разного размера), а также различные буферные растворы (разд. 6.1), запас достаточно чистого сульфата аммония (разд. 3.3), тиоловые реактивы, такие, как 2-меркаптоэтанол и дитиотреитол, ЭДТА (этилендиаминтетра-уксусная кислота), додецилсульфат натрия, протаминсульфат, фенилметилсульфонилфторид, реактив Фолина — Чиокальтеу, кумасси синий и т.д.; их использование будет описано в разных разделах этой книги.
Лаборатория очистки ферментов
13
1.2. ОТДЕЛЕНИЕ ОСАДКОВ И НЕРАСТВОРИМЫХ ВЕЩЕСТВ
Фильтрация
Появление в лабораториях эффективных центрифуг с охлаждением дало возможность использовать более чистый и совершенный по сравнению с фильтрацией способ отделения белковых и других осадков, особенно при работе с малыми объемами. Однако бывают случаи, когда фильтрация предпочтительнее. При проведении крупномасштабной работы центрифугирование больших объемов может потребовать применения нестандартного оборудования, например проточной насадки (адаптера) (рис. 1.1); во всяком случае, этот процесс может быть таким же длительным, как и фильтрация. С другой стороны, большинство биологических материалов дают обильные и рыхлые осадки, которые быстро закупоривают фильтры, так что вскоре после начала фильтрации скорость потока резко уменьшается и фильтрация почти прекращается даже при отсасывании. В этой ситуации необходимо заменить фильтрующий материал. В производственных условиях можно использовать специальные жесткие фильтры с автоматическим соскабливающим устройством для удаления слизистого осадка по мере его накопления, но такие системы обычно не применяются в лаборатории.
Процесс фильтрации может быть значительно ускорен, если использовать целит — диатомовую землю, состоящую в основном из Si02 (рис. 1.2). Наилучшие результаты получают при смешивании целита с фильтруемым образцом и последующем пропускании его через бюхнеровскую воронку под небольшим вакуумом. Целит создает очень большую поверхность, задерживающую студенистый осадок, что позволяет получить значи-
Рис. 1.1. Упрощенная схема проточного адаптера для ротора центрифуги «Sor-vall SS-34>. Раствор может подаваться со скоростью нескольких сотен миллилитров в 1 мин, при этом собирается до 300 см3 «садка.
14
Глава 1
1. Целит смешивают с буфером
2* Суспензию выливают на воронку для фильтрования, чтобы получить слой целита
4. Суспензию выливают на слой целита; при этом образуется новый слой целита, смешанный с частицами из белкового раствора
Чистый раствор белка ^
Рис. 1.2. Использование целита как фильтрующего средства для осветления белковых растворов.
тельно больше фильтрата, прежде чем произойдет засорение фильтра. Этот способ используется в основном для удаления небольших количеств нежелательных нерастворимых веществ, но не приводит к успеху при работе с большими количествами осадка.
