Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
/ = —77—-—---------------------------------------=-—- (4.11)
' P(Va+ Vs) + Фа Va+( 1 - a) Ke ' 4
В табл. 4.10 показано, насколько близким к единице должен быть коэффициент а, чтобы выход по адсорбции был до-
Таблица 4.10. Доля белка (/), адсорбированного при различных условиях адсорбции «в объеме» [из уравнения (4.11)]
0,05 0,9 0,30 0,05 0,98 0,70
ол 0,9 0,45 0,1 0,98 0,82
0,2 0,9 0,60 0,1 0,98 0,89
0,5 0,9 0,75 0,1 0,99 0,99
0,1 0,95 0,63 0,02 0,998 0,91
0,2 0,95 0,76 0,05 0,998 0,96
0,5 0,95 0,86
192
Глава 4
статочно высоким — порядка 80—90%. Большинство адсорбентов должно иметь значения Кр меньше, чем 10”6 М, чтобы величина а была 0,98 или выше. При \а больше 0,99 можно использовать очень малое количество адсорбента. Если в растворе присутствует в малых количествах только требуемый фермент, значение Va/Vs = 0,02 будет достаточно разумным. Однако обычно адсорбенты не столь специфичны — с ними может связываться большое количество других белков, понижая тем самым их эффективную емкость.
Аффинные адсорбенты значительно более селективны, но, как указывалось в разд. 4.6, без заметных неспецифических взаимодействий едва ли можно добиться, чтобы значения Кр были меньше 10_6 М. Если аффинный сорбент содержит лиганд, очень прочно связывающийся с ферментом, и неспецифические взаимодействия малы (благодаря использованию гидрофильных «мостиков» или вследствие прямого присоединения лиганда к матрице), то адсорбция фермента на таком сорбенте «в объеме» может дать весьма хорошие результаты. Особенно пригодны для адсорбции «в объеме» иммуноадсорбенты, поскольку они избирательно и прочно связывают антиген. Адсорбенты, модифицированные красителями, также удовлетворяют этим условиям, однако они сравнительно менее специфичны. В данном случае может понадобиться весьма большое количество адсорбента, чтобы адсорбировать весь желаемый фермент. Так, 90% глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (из дрожжей и бактерий) можно адсорбировать из сырого экстракта на сефарозе ЗВ, модифицированной проционовым красным НЕ, при соотношении Va/Vs — 0,1. Как видно из табл. 4.10, величина а равна в этом случае 0,99 или больше.
Иногда возникает необходимость установить, имеет ли адсорбция «в объеме» преимущество по сравнению с колоночной хроматографией. Методы адсорбции «в объеме» дают возможность быстро обработать большие объемы материала, но если значение а не превышает существенно 0,98, потери вещества неизбежны. На колонке можно достичь 100%-ной адсорбции, даже если а=0,95, но хроматографические методы более трудоемки и занимают больше времени, и, кроме того, поверхность адсорбента может забиваться при использовании сырых экстрактов. Рассмотрим следующую ситуацию: к 1 л исходного материала добавляют 100 см3 адсорбента. При этом сорбируется 63% фермента (а=0,95, табл. 4.10). Если то же значение а реализуется на колонке и емкость ее (mt) намного больше, чем присутствующее в образце количество фермента, то при пропускании всего образца через колонку объемом 100 см3 передний край зоны неадсорбированного белка будет локализован в середине колонки {скорость перемещения = скорость потоках
Разделение белков путем адсорбции
19?
Х(1—а); пропущенный объем равен 1 л и, следовательно, пере-мёщение = 50 см3]. Промывка колонки еще одной порцией буфера объемом 500 мл не приведет к элюции фермента, так что последующая ступенчатая или градиентная элюция даст прекрасное хроматографическое разделение. Если же объем исходного экстракта увеличить, например, до 20 л, то при использовании колонок могут возникнуть трудности. Вопрос заключается в том, достаточна ли 63%-ная адсорбция при обработке материала в объеме, учитывая, что еще некоторое количество может быть потеряно при промывке. На этот вопрос, по-видимому, следует ответить отрицательно — нужно или несколько повысить значение а, или увеличить количество адсорбента. Добавив к исходному раствору удвоенное количество адсорбента, можно достичь 76%-ного извлечения фермента (табл. 4.10), что, конечно, более приемлемо. Возможно, что разбавление исходного раствора водой и, следовательно, снижение ионной силы вдвое приведет к возрастанию а. При том же количестве (100 см3) адсорбента, если даже а увеличится с 0,95 до 0,98, извлечение повысится лишь до 70% на стадии адсорбции из-за изменения соотношения объемов (Va/Vs станет равным 0,05).
Даже в том случае, когда фермент совсем не адсорбируется, обработка исходного раствора путем добавления к нему порции адсорбента может быть чрезвычайно полезной, так как при этом удаляются другие белки. Пример такой обработки приведен в предыдущем разделе. В дрожжевой экстракт добавляли сначала гидроокись цинка, а затем бентонит. Большая часть белкового материала адсорбировалась, а вся фосфоглюкозоизомераза оставалась в растворе [111] (см. табл. 4.9). Существует много других примеров обработки экстрактов адсорбентами; иногда она проводится с целью «осветления» экстракта, но сопровождается также адсорбцией ненужного материала. Даже тогда, когда достигается лишь небольшая степень очистки (например, только 10—20%-ное повышение удельной активности), удаленный белок может оказаться важной примесью, мешающей реализации последующих стадий очистки.
