Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Агароза содержит много метиленовых и гидроксильных групп, поскольку она построена из ангидрогалактановых остатков. Благодаря своей амфифильной природе эти матрицы (частично гидрофобные и частично гидрофильные), может быть, даже больше подходят для адсорбции белков при высоких концентрациях соли, чем чисто гидрофобные материалы [121]* Действительно, агароза оказалась наиболее удачным носителем для проведения высаливающей хроматографии. Белки адсорбируются на агарозе при концентрации соли, несколько более низкой, чем концентрация, требуемая для их осаждения из раствора. Поэтому нет необходимости и даже нежелательно предварительно осаждать белки и наносить их на колонку в виде суспензии. Здесь возможны следующие два приема. 1) К белковому раствору добавляют сульфат аммония до концентрации, несколько более низкой, чем нужно для осаждения выделяемого фермента; образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и надосадочную жидкость наносят на колонку, уравновешенную раствором сульфата аммония той же концентрации. 2) Агарозу смешивают с образцом (примерно 1 см3 на 20 мг белка) и
Разделение белков путем адсорбции
187
медленно добавляют сульфат аммония до тех пор, пока его концентрация (рассчитанная на суммарный объем агарозы и образца) не будет примерно такой, которая нужна, чтобы осадить белок из раствора. Агарозу затем переносят в верхнюю часть не до конца заполненной колонки, подготовленной, как указано выше. В обоих случаях на агарозе сорбируются молекулы белков, а не их агрегированные формы, и ее поверхность (как наружная, так и внутренняя) покрывается слоем белка, составляющим 30 мг/см3. После промывания колонки исходным буфером начинают градиентную или ступенчатую элюцию раствором с понижающейся концентрацией соли. Этот метод основан на том же принципе, что и гидрофобная хроматография, однако на агарозе, вероятно, не остается адсорбированного белка при низкой концентрации соли. Слабо выраженный гидрофобный характер агарозы компенсируется тем, что на стадии адсорбции используется более крепкий солевой раствор.
Описанный метод получил дальнейшее развитие, и на его основе был разработан прием «аффинной» хроматографии [122], который сводится к тому, что в буферный раствор добавляют лиганд, изменяющий адсорбционные характеристики. Будь то гидрофобные адсорбенты или агароза, принципы аффинной хроматографии остаются теми же, что и в случае использования более специфических адсорбентов (разд. 4.5) или ионообменников (разд. 4.4). Сначала в отсутствие лиганда находят условия, которых еще не вполне достаточно, чтобы вызвать нужный эффект (в данном случае элюцию). Затем добавляют лиганд, что слегка нарушает установившееся равновесие и приводит к ожидаемому эффекту. Важно, чтобы при добавлении лиганда происходило заметное изменение существенного для очистки свойства, в данном случае — гидрофобного взаимодействия. Лиганд должен сохранять способность связываться с ферментом в условиях, существующих в колонке, т. е. при высокой концентрации соли. Примером «аффинного осаждения» может служить очистка некоторых тРНК-аминотрансфераз [122]: связывание крупной молекулы тРНК приводит к заметному снижению адсорбционной способности колонки, что позволяет осуществлять элюирование.
Комплексы протамин — нуклеиновая кислота как адсорбенты
Первая стадия очистки экстрактов, полученных из микроорганизмов и других быстрорастущих клеток, содержащих большие количества нуклеиновых кислот, состоит обычно в осаЖ' дении последних протаминсульфатом (см. разд. 2.3). Получен* ный осадок, как правило, содержит мало других белков, кроме
188
Глава 4
нуклеопротеинов, и процесс осаждения заключается просто в удалении ненужного материала из экстракта. Однако иногда после осаждения протамином наблюдается значительное снижение активности какого-нибудь фермента, но если осадок экстрагировать подходящим буфером, то удается вновь регенерировать потерянную активность. В таких случаях это явление можно использовать как важный способ очистки. Так, а-кетоглута-ратдегидрогеназа из Е. coli адсорбируется на осадке, содержащем комплекс протамин—нуклеиновая кислота, и экстрагируется из неге 0,1 М фосфатным буфером при pH 7 [123]. Недавно свойство дрожжевой фосфофруктокиназы полностью сорбироваться на протаминовом осадке также было использовано для ее очистки ![17]. Поскольку эти ферменты функционируют в присутствии нуклеотидов, адсорбция может быть обусловлена взаимодействием экспонированнного нуклеотидсвязывающего участка с нуклеиновой кислотой.
Адсорбенты со смешанной функцией
За десятилетие, прошедшее со времени первого описания биполярных ионообменников {69], они не получили широкого распространения, несмотря на то что описанные свойства этих сорбентов представляются весьма полезными. Связывание суль-фаниловой кислоты и аргинина с активированной эпихлоргид-рином агарозой (сефарозой 6В) приводит к образованию биполярных заместителей (рис. 4.53). Значение р/С„ вторичной аминогруппы в сульфанилсефарозе оказалось равным 7,25, а в
