Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Моноклональные антитела
Большинство проблем, возникающих при использовании по-ликлональных антител, может быть решено с помощью новой технологии получения моноклональных антител [106]. Применяемые при этом оборудование и методы достаточно просты, но к ним предъявляются более высокие требования, чем при производстве обычных антител. Моноклональные антитела по-сравнению с поликлональными имеют следующие преимущества при получении иммуноадсорбентов:
1) Используемый препарат фермента не нуждается в очистке; процесс скрининга подходящих клонов позволяет избавиться от антител к другим белкам. В этом случае достаточно 1%-ной «чистоты» исходного фермента [107].
2) Поскольку иммунизация обычно проводится на мышцах*, требуется очень небольшое количество антигена (достаточно всего 50 мкг).
3) Можно обнаружить много различных клонов, продуцирующих антитела к разным антигенным детерминантам нужного фермента. Константы диссоциации комплексов этих антител с ферментом будут различаться. Можно отобрать клоны,, продуцирующие антитела с Kd в желаемой области (10“6— 10~8 М), тем самым решив проблему, связанную с элюцией.
4) Подходящий клон, будучи однажды найден, может храниться в жидком азоте и быть, таким образом, неисчерпаемым источником антител, которые можно получать от многих особей данного вида животных. Источник не иссякает со-смертью животного.
5) Поскольку моноклональные антитела — это чистый препарат антител, все молекулы связанного на адсорбенте иммуноглобулина специфичны по отношению к нужному ферменту. Таким образом, емкость иммуноадсорбента обычно увеличивается по меньшей мере в 10 раз.
12—1078
178
Глава 4
Первые крупные успехи в использовании моноклональных иммуносорбентов были связаны с очисткой интерферона человека [107], а также сахаразы/изомальтазы из щеточной каемки тонкого кишечника [108]. Со времени опубликования этих данных, без сомнения, появились и другие сообщения на ту же тему.
Поскольку иммуноадсорбенты (поликлональные и моноклональные) обладают высоким сродством к выделяемому ферменту, их удобно использовать для адсорбции «в объеме» (см. разд. 4.9)Однако образование комплекса между антигеном и антителом — обычно медленный процесс; следовательно, сорбируя фермент «в объеме» или на колонке, необходимо, чтобы было достаточно времени для завершения адсорбции. Важно также, чтобы в ходе элюции скорость потока была очень низкой; может оказаться полезным даже совсем прекратить про-лускание элюента [104].
4.8. РАЗЛИЧНЫЕ АДСОРБЕНТЫ
Неорганические адсорбенты
Все до сих пор рассмотренные в этой главе адсорбенты, за исключением некоторых упомянутых синтетических полимеров, построены на основе биологических матриц. Существует также ряд неорганических веществ, использовавшихся для адсорбции белков, — в основном оксиды, нерастворимые гидрооксиды и •фосфаты. Главное место среди них занимает гидроксифосфат кальция, который в кристаллическом состоянии известен как гидроксилапатит. Использование гидроксилапатита и студнеобразной формы «геля фосфата кальция» будет описано ниже в заключительной части этой главы, посвященной адсорбции «в объеме». Тем не менее краткое описание этих адсорбентов даст представление о пригодности неорганических материалов для адсорбции белков. Одно из отличительных преимуществ таких материалов, особенно при крупномасштабном или промышленном применении, — это их дешевизна; часто не стоит труда очищать их после однократного использования.
В отношении механизма действия неорганические материалы менее понятны по сравнению с ионообменниками или аффинными сорбентами. Кристаллические поверхности состоят из заряженных ионов, ассоциированных с гидратной водой, и потому электростатические взаимодействия играют важную роль при сорбции на них белков. Однако рядом с любой положительно заряженной областью на поверхности кристалла находится отрицательно заряженный участок, и наоборот. Следовательно, взаимодействие скорее носит характер полярного диполь-ди-
Разделение белков путем адсорбции
179
Белок
Поверхность неорганической соли А
Рис. 4.50. Электростатические взаимодействия белков с поверхностью неорганической соли. А. Простое взаимодействие. Б. Взаимодействие в присутствии ионов буфера.
польного связывания, чем ионного обмена (рис. 4.50,Л). При нейтральных значениях pH белки, по всей вероятности, имеют соседствующие положительные и отрицательные группировки. Таким образом, независимо от значения изоэлектрической точки адсорбция будет скорее всего происходить при pH от 6 до 9.
Однако на практике все оказывается значительно сложней, чем в теории. При адсорбции всегда используют буферные растворы, обычно фосфат, и ионы буфера сами сорбируются на неорганических материалах. Поэтому гидроксилапатит может иметь полностью отрицательно заряженную поверхность для связывания белка (рис. 4.50, Б). Повышение концентрации буфера приводит к конкуренции между белком и ионами буфера за заряженные участки на поверхности адсорбента, что напоминает типичную картину ионного обмена. Детальное обсуждение этих эффектов, а также количественные данные по адсорбции некоторых белков на гидроксилапатите и ТЮ2 представлены в работах [109, 110].
