Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
/% от К
Рис. 5.6. Влияние объема образца на профиль элюции с гель-фильтругощей колонки [29]. Несмотря на то что теоретический нулевой объем соответствует пику I, вследствие диффузии пик белка размывается до объема, близкого к II. В случае III объем образца больше идеального, в результате чего общий объем элюции увеличивается. В случае IV объем образца слишком велик и разделение молекул возможно, только если их размеры различаются не менее чем в четыре раза.
Разделение ¦ растворе
207
*
с
Рис. 5.7. Идеальное разделение пяти белков на гель-фильтрующей колонке [29]. Каждый из этих белков по массе отличается от следующего за ним белка в два раза. На колонку нанесено одинаковое количество каждого бел» ка. Высота пиков снижается из-за большей диффузии более мелких молекул.
«еидеальность потока вызывают почти одинаковое размывание пика независимо от объема образца (рис. 5.6).
При элюции 90% каждого компонента обычно выходит в объеме, составляющем 8—10% общего объема колонки, причем размывание пиков зависит в некоторой степени от положения пика элюции. Первые фракции, содержащие самые крупные молекулы, быстрее проходят через колонку и поэтому в меньшей степени подвержены эффектам турбулентности. Следовательно, размывание пика будет тем меньше, чем раньше выходит фракция. Кроме того, молекулы меньших размеров имеют более высокий коэффициент диффузии, что приводит к дополнительному размыванию. Идеализированный профиль элюции, отражающий эту ситуацию, показан на рис. 5.7. Если молекулы нужного фермента имеют небольшие размеры, то его пик будет в большей степени размываться при элюции и с большей вероятностью 'будет загрязнен белками сходных размеров. Если же фермент элюируется вначале, то пик будет острее, но при наличии большого количества высокомолекулярных примесных белков вполне вероятно, что они будут перекрываться с фракцией фермента (рис. 5.8). Таким образом, интервал фракционирования следует выбирать, принимая во внимание как размеры основных загрязняющих молекул, так и величину молекулы выделяемого фермента.
Важное значение имеют размеры колонки, в том числе ее ¦общий объем, а также соотношение длины и диаметра. В иде--алъных условиях последний параметр не должен был бы играть существенной роли. Действительно, толстая и короткая «солонка имеет то преимущество, что она позволяет достичь
208 Глава 5
А
Рис. 5.8. Отделение одного белка (заштрихован) от других на гель-фильтрующей колонке с использованием материалов различной пористости, А. Крупнопористый материал — фермент элюируется позднее и хорошо отделяется от белков А и В, но не от белка D, Б, Мелкопористый материал—фермент элюируется вблизи свободного объема и перекрывается с белком В; хорошо отделяется от белка D.
больших скоростей потока и уменьшить его турбулентность, что приводит к меньшему размыванию пиков (см. рис. 1.7). С другой стороны, разрешение у такой колонки может быть ниже, поскольку число гранул, а следовательно, и число элементарных актов гель-фильтрации, совершающихся по мере того, как белки входят в частицы геля и выходят из них, в расчете на каждую молекулу, будет меньше. Но главный недостаток короткой й толстой колонки заключается в том, что в ней трудно добиться равномерного нанесения образца и равномерного потока буфера. Даже если зона каждого компонента, которая по форме должна представлять собой правильный диск, искажается лишь в малой степени, это приводит к плохому разрешению (рис. 5.9).
В длинной и тонкой колонке белковые зоны менее подвержены искажениям в горизонтальной плоскости; во всяком случае такие искажения здесь не столь важны, так как образец занимает большее расстояние по высоте колонки (рис. 5.9). В повседневной практике гель-хроматографию проводят в колонках, длина которых в 20—40 раз превышает их диаметр. Неравномерное нанесение образца, искажение хроматографического слоя у стенок колонки в результате поверхностного натяжения и другие причины, приводящие к неравномерности пото-
Разделение в растворе
209-
Профиль
элюции
тм
Б
В
Г
Рис. 5.9. Сравнение гель-фильтрации в толстой и короткой колонке с гель^ фильтрацией в длинной колонке. При идеальном потоке (Л и В) должны получаться одинаковые результаты. Незначительные отклонения потока в короткой колонке (?) приводят к плохому разрешению, но существенно не влияют на результаты в длинной колонке (Г).
ка, в таких колонках оказываются менее существенными, чем в коротких и толстых колонках того же объема.
Компактность белковой зоны может зависеть от способа нанесения образца (см. ниже). Столь же важно обратить внимание на поведение выходящей из колонки белковой зоны. Перемешивание белковых зон в продольном направлении при использовании слишком широких колонок — частая ошибка, во многих случаях сводящая на нет результаты превосходного разделения. По той же причине проточные кюветы для регистрации количества белка должны иметь малые размеры, чтобы свести к минимуму возможность такого перемешивания; кроме того, их следует помещать как можно ближе к выходному отверстию колонки (рис. 5.10).
