Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 4.45. Сходство трехмерных структур цибакрона голубого F3GA и NAD [90]. Слева — пространственная модель NAD, справа — ориентированная таким же образом модель цибакрона голубого F3GA.
Разделение белков путем адсорбции
165
НО
1
NH
N^?N
О
NH'
Рис. 4.46. Структура цибаркона голубого F3GA и взаимодействие его с гидроксильными группами.
большие размеры, что значительная часть пор внутри частиц агарозы для него недоступна. Тем не менее емкость голубого декстрана — агарозы достаточно высока, так как доля присоединенного активного лиганда, способного связывать белки, значительно выше, чем у обычного аффинного адсорбента.
Связывание голубого декстрана с агарозой — это чрезвычайно сложный процесс. Сам краситель достаточно реакционноспособен и может присоединяться непосредственно к неактиви*-рованной агарозе. Дело в том, что этот краситель, так же как и другие, описанные далее, был разработан для окрашивания биологических полимеров (шерсть, хлопок). Красители присоединяются к ним через триазинилхлоридную группу в слабощелочной среде (рис. 4.46). Агароза имеет много реакционноспособных гидроксильных групп, и прямое присоединение к ней красителя позволяет получить ряд замещенных адсорбентов с различной концентрацией красителя, обычно до 5 мкмоль • см-3 (набухший гель). Емкость этих адсорбентов для белков в 10— 20 раз превышает емкость истинных аффинных адсорбентов; для низкомолекулярных белков она составляет 20—30 мг-см-3, но по мере увеличения размеров белковых молекул снижается
166
Глава 4
за счет ситового эффекта геля. При низкой ионной силе и относительно низких значениях pH окрашенные адсорбенты являются также эффективными катионообменниками, так как благодаря наличию множества отрицательных зарядов эти адсорбенты связывают основные белки, которые могут и не иметь специфических нуклеотидсвязывающих центров. Если нет необходимости использовать это свойство, окрашенный адсорбент следует применять в условиях, при которых он ведет себя как слабый катионообменник, например при pH 7 или выше и ионной силе, равной 0,1.
Следует заметить, что прямое присоединение красителя к остову матрицы не уменьшает способность красителя связывать ферменты, т. е. в этом случае не нужен удлиняющий мостик. Как упоминалось в предыдущем разделе, причина, по которой при слабом взаимодействии фермента с лигандом необходим мостик, заключается не столько в возможности расположить лиганд на некотором расстоянии от матрицы, сколько в том, что введение мостика приводит к появлению неспецифических сил взаимодействия, усиливающих связывание. При величине Ki(Kp), лежащей в пределах 10_6 М, и высоких значениях mt для хорошей адсорбции белка на колонках с окрашенным адсорбентом не требуется дополнительных взаимодействий. Это видно из уравнения (4.5), например, при /«/ = 0,1 мМ, pt — = 0,05 мМ и /Ся = 0,001 мМ а=0,98. Из сказанного должно следовать, что окрашенные адсорбенты идеально приспособлены для белков, связывающих нуклеотиды, особенно в сочетании с аффинной элюцией. На практике же возникает ряд трудностей. Главная из них заключается в неспецифических силах связывания, которые могут быть причиной менее эффективной аффинной элюции. Кроме того, существует такое множество белков, связывающих нуклеотиды, что если все эти белки, присутствующие в смеси, адсорбируются на колонке, то высокой степени очистки получить не удастся.
В последние годы исследование большого числа красителей позволило улучшить избирательность метода, так как ферменты проявляют неодинаковое сродство к различным красителям. Сначала заметили, что NADP-зависимые ферменты связываются с проционовым красным НЕ-ЗВ более прочно, чем с цибакро-ном голубым F3GA, тогда как большинство NAD-зависимых ферментов, наоборот, более прочно связывают цибакрон голубой F3GA [92]. Позже фирма Amicon выпустила еще три апробированных адсорбента [93]. Были проверены также другие красители, проявляющие специфичность по отношению к некоторым ферментам [94—96]. Вероятно, следует пожалеть, что сейчас существует такое разнообразие методик (включая рабочие параметры; см. ниже), так как из-за этого хроматография на ок-
Разделение белков путем адсорбции
167
рашенных адсорбентах становится весьма сложным процессом но сравнению с тем, что было в начальный период ее развития, когда выясняли лишь одно — «приклеивается» фермент к голубому декстрану или нет. Фирма Amicon предложила специальный набор, состоящий из пяти красителей; была проверена адсорбционная способность 90 различных красителей по отношению к целому ряду ферментов [97].
Существует несколько блестящих примеров успешного применения окрашенных адсорбентов, но в большинстве случаев их используют как определенный этап очистки, которому предшествуют или за которым следуют другие этапы. Правильное применение принципов аффинной элюции к процессу хроматографии, несомненно, способствовало бы усовершенствованию некоторых опубликованных методик.
Получение окрашенных адсорбентов
