Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
1.3.3. Метод EPL в белковой инженерии
Как можно видеть из вышеизложенного, метод EPL обладает большими преимуществами перед подходами, основанными на использовании только химических методов синтеза полипептидов. При использовании лигирования синтезированных белков большая часть белковой молекулы может быть синтезирована рибосомами, и полученные фрагменты полипептидных цепей далее легко объединяются с пептидами, синтезированными хими-
чески. Это позволяет проводить почти любые направленные изменения небольших участков полипептидных цепей сложных белковых молекул и изучать их влияние на функциональность исследуемых белков. В участки полипептидных цепей, полученных химическим синтезом, можно вводить любые функциональные группы, в том числе и аналоги аминокислотных остатков, которые невозможно включить в состав полипептидных цепей с использованием аппарата трансляции. С учетом таких возможностей, метод EPL был немедленно использован для сайт-специфи-ческого введения в белки разнообразных молекулярных зондов, включая флуорохромы и стабильные изотопы, что позволило эффективно исследовать структурно-функциональные отношения в сложных белках и макромолекулярных комплексах. Метод EPL дает возможность получать производные белков чрезвычайно высокой молекулярной массы, что в настоящее время невозможно сделать никакими другими методами. В частности, с помощью этого метода были получены модифицированные производные |3'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli, длина полипептидной цепи которой составляет 1407 а.о. [47].
Методом EPL в настоящее время уже исследованы десятки белков прокариотических и эукариотических организмов. В этот список входят киназы, фосфатазы, факторы транскрипции, РНК-полимеразы, белки, участвующие в цитоплазматической передаче сигналов, ионные каналы, рецепторы и антитела. Ниже мы кратко рассмотрим некоторые из наиболее важных приложений метода EPL в белковой инженерии.
Имитация посттрансляционных модификаций белков. Пост-трансляционные модификации белков являются одним из важнейших этапов экспрессии генов. Большинство эукариотических белков становятся функционально-активными лишь после ковалентного присоединения к их функциональным группам модифицирующих молекул. Кроме того, посттрансляционные модификации, например, фосфорилирование или ацетилирование белковых молекул, являются важным механизмом регуляции их биологической активности. Исследование молекулярных механизмов регуляции активности белков под действием их ковалентных модификаций сдерживается отсутствием адекватных модельных систем. Например, стандартным методом получения специфически фосфорилированных белков является их инкубация с соответствующей протеинкиназой в присутствии субстратов. Однако обычно не удается контролировать уровень фосфорилирования белка, а также специфичность самой реакции. Использование Метода EPL позволяет решить эту проблему путем объединения
рекомбинантных немодифицируемых фрагментов исследуемого белка с требуемым модифицированным фрагментом, синтезированным химическими методами. В частности, методом EPL удалось получить фосфорилированный по четырем критическим положениям рецептор трансформирующего фактора роста |3 типа I (TJ3R-I), объединяя синтетический модифицированный фрагмент полипептидной цепи с соответствующим рекомбинантным фрагментом фактора. Оказалось, что фосфорилирование, приводящее к активации T|3R-I, увеличивает его сродство к природному субстрату - фактору транскрипции Smad2 и уменьшает к белку-ингибитору FKBP12 [74]. Данные такого рода позволили построить новую модель механизма активации рецептора T|3R-I. В аналогичных опытах с белком Smad2 было установлено, что его фосфорилирование сопровождается образованием тримера, диссоциацией его комплекса с рецептором и гетероолигомеризацией с регуляторным белком Smad4 [75]. С помощью аналогичного подхода начато исследование молекулярных последствий гликозилирования и липидирования белков. Последняя посттран-сляционная модификация включает N-концевое меристоилиро-вание, присоединение остатков холестерина к С-концам, S-npe-нилирование (присоединение фарнезильных и геронилгерониль-ных групп) остатков Cys вблизи С-концов белковых молекул, а также S-пальмитоилирование остатков Cys вдоль полипептид-ных цепей [76]. Липидирование белков повышает их сродство к мембранам, что оказывает влияние на внутриклеточную локализацию и функции образующихся липопротеинов.
Приведенные примеры показывают, что метод EPL позволяет легко объединять белки как друг с другом, так и со многими химическими соединениями другой природы.
Гпава 2
Направленная эволюция белков
Основные идеи, лежащие в основе обсуждаемого подхода к получению новых белковых молекул с требуемой биологической активностью, заимствованы из дарвиновской теории биологической эволюции, объясняющей причины разнообразия жизни на Земле. В соответствии с концепциями неодарвинистов, внутривидовое генетическое разнообразие, которое является следствием глобального мутационного процесса, рано или поздно находит свое фенотипическое проявление. Фенотипически различающиеся организмы конкурируют друг с другом за жизненное пространство и ресурсы, что сопровождается борьбой за существование и естественным отбором, в результате которых выживают те мутантные особи, фенотип которых наиболее приспособлен к данным экологическим условиям.
