Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
2.2.1. Химический мутагенез
Делеции и вставки, создаваемые в структурных частях генов, как правило, их инактивируют, особенно в тех случаях, когда эти мутации приводят к сдвигу открытых рамок считывания. Поэтому делеции и вставки in vitro используют главным образом для поиска и изучения регуляторных элементов генов, влияющих на эффективность их экспрессии. Большое значение для исследования функционирования белков имеют методы мутагенеза in vitro, направленные на получение точковых мутаций, следствием которых являются одиночные замены аминокислот в полипептидных цепях. Распространенным методом введения большого числа точковых мутаций разной локализации в исследуемые части генов in vitro является химический мутагенез одноцепочечных участков рекомбинантных ДНК. Принцип подобных методов заключается в том, что некоторые химические мутагены, такие как бисульфит натрия, гидроксиламин или метоксиламин, действуют
только на одноцепочечные участки ДНК. Следовательно, получив молекулы ДНК, содержащие одноцепочечные бреши в исследуемых участках генов, можно с помощью бисульфита натрия дезаминировать остатки цитозина в этих участках, т.е. превратить их в остатки урацила. После достройки цепи такой мутаге-низированной молекулы ДНК с помощью фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I Е. coli происходит замена исходных G-C-nap на Т-U. Затем мутагенизированные молекулы ДНК с помощью трансформации вводят в бактериальные клетки, где по завершении первого раунда репликации в молекуле осуществляются замены остатков U на Т и полная замена G-C-пары на А-Т, т.е. имеет место обычная транзиция.
Одноцепочечные мутагенизированные участки ДНК удобно получать путем гибридизации одноцепочечной и двухцепочечной ДНК одного и того же вектора, содержащего клонированный ген или его участок, который необходимо мутагенизировать. В этом случае в образующемся гибриде-гетеродуплексе, одна цепь которого принадлежит вектору без вставки, а другая - вектору со вставкой, происходит выпетливание последовательности вставки в виде одноцепочечного участка ДНК. Обсуждаемый подход к получению статистического набора точковых мутаций с использованием химических мутагенов позволяет легко создавать большое число мутантных молекул ДНК, содержащих одну или несколько мутаций в разных сочетаниях. Последующий отбор мутантов на основе новых биохимических или иных параметров мутантных белков (исчезновение, ослабление или усиление ферментативной активности, появление новой активности или новых иммунологических свойств и т.п.) дает возможность идентифицировать остатки аминокислот в исследуемых белках, отвечающие за эти изменения.
Несмотря на удобство введения такого рода мутаций в ДНК in vitro, химический мутагенез накладывает ограничения на спектр возникающих мутаций, так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают обязательные изменения. Поэтому многие мутации никогда не могут быть получены с помощью химических мутагенов. Проблему можно частично решить, используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов, например, N-гидроксицитозинтри-фосфат, который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с А и G, или создавая такие условия, при которых репарирующая ДНК-полимераза начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды. Все перечисленные выше методы локального мутагенеза, осу-
ществляемого in vitro, позволяют, в конечном счете, получать набор случайных мутаций, локализованных на определенном исследуемом участке ДНК. Мутагенизированные молекулы ДНК из одной реакционной пробирки представляют собой сложную смесь, в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций. Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить трудоемкую процедуру отбора, сопряженную с анализом большого числа мутантов. Подлинную революцию в направленном мутагенезе произвела разработка методов с использованием ПЦР и синтетических олигонуклеотидов.
2.2.2. Синтез ДНК с ошибками
Искусственное увеличение частоты включения в продукт ПЦР некомплементарных матрице (ошибочных) нуклеотидов во время проведения реакции является простым и широко используемым методом получения последовательностей нуклеотидов, измененных случайным образом. Имеется несколько способов уменьшения точности синтеза ДНК во время ПЦР, среди которых следует отметить создание специальных (неоптимальных) условий проведения реакции и использование специальных ДНК-полимераз.
Как уже упоминалось в разделе 3.1.5 первой части книги, повышение концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и ионов Mg2+ в реакционной смеси приводит к возрастанию числа ошибок амплификации ДНК во время ПЦР. К тем же последствиям ведет замена ионов Mg2+ на ионы Мп2+ или их совместное использование [80]. Для достижения максимального мутагенного эффекта необходимо соблюдать определенное соотношение между концентрациями всех четырех дезоксирибонуклеозидтри-фосфатов в инкубационной смеси [81]. К сожалению, даже в оптимальных условиях замены нуклеотидов в системах такого рода не происходят случайным образом: транзиции (замены пурина на пурин и пиримидина на пиримидин) превалируют над трансверсиями (замены пурина на пиримидин и наоборот). Благодаря этому, в результате такого мутагенеза в среднем было обнаружено появление в конкретном участке мутантной полипептидной цепи лишь 5,7 а.о. из 20 теоретически возможных [82]. Следовательно, данный подход в его обычном воплощении не пригоден для создания репрезентативных клонотек нуклеотидных последовательностей, кодирующих все возможные варианты полипептидных цепей, исследуемых методом направленной эволюции.
