Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
При искусственном отборе, осуществляемом человеком, проводится направленная селекция индивидуумов, фенотип которых отвечает требованиям селекционера. В этом случае лимитирующим фактором становится количество фенотипов, доступных экспериментатору. По мере углубления понимания молекулярных механизмов изменчивости живых организмов появилась возможность искусственно влиять на нее посредством усиления процесса мутагенеза с помощью тех или иных мутагенов.
С учетом этих простых и “очевидных” соображений легко сделать следующий шаг от живых организмов к молекулам с тем, чтобы применить вышеупомянутые принципы к молекулярным объектам для получения молекул с нужными свойствами. Но поскольку “легко срубить только упавшее дерево”, такой шаг суждено было сделать отнюдь не нам, а Солу Спигельману с соавт. в 1965 г. [77].
Опыты С. Спигельмана. В классических опытах С. Спигель-мана была использована система репликации геномной РНК бактериофага Q|3 in vitro, в которой синтез РНК осуществлялся Qp-репликазой. Помимо фермента и матрицы исходная смесь содержала все четыре рибонуклеозидтрифосфата, т.е. предшественники мономеров реплицируемых макромолекул, необходимые для построения комплементарных цепей РНК. После инкубации в течение определенного времени, достаточного для синтеза полноразмерных молекул РНК, аликвоту реакционной смеси Переносили в новую пробирку, содержащую все исходные компо-
Рис. 42. Изменение скорости синтеза Qp-РНК в опытах С. Спигельма-на [78]
Скорость синтеза РНК измеряли по включению радиоактивного GTP; после проведения определенного количества циклов отбора имело место скачкообразное возрастание скорости синтеза РНК
ненты кроме РНК, и инкубацию продолжали в течение того же времени. Поскольку точность репликации РНК Qp-репликазой невысока, ожидалось, что в результате серийных переносов будут постепенно отбираться мутантные молекулы матрицы с более высокой скоростью репликации, которые, в конце концов, вытеснят исходные молекулы.
Ожидания авторов полностью подтвердились. После 70 пассажей скорость репликации QJ3-PHK возросла в ~10 раз. Конечную популяцию составляли укороченные мутантные РНК, более эффективно используемые в репликации. Уже после первых пассажей имело место трехкратное повышение скорости репликации (рис. 42), переход к более высоким скоростям носил ступенчатый характер. На первых переносах наблюдалось уменьшение скорости репликации, по мнению авторов, связанное с появлением (из-за накопления мутаций) неблагоприятных для репликации вариантов макромолекул.
По современным представлениям, в том случае, когда накопление мутаций в популяции эволюционирующих молекул не нейтрально по отношению к их “фенотипу”, в ней имеется преобладающая последовательность (master sequence), которая в наибольшей степени приспособлена к условиям воспроизведения in vitro [78]. Кроме того, если мутации возникают достаточно часто, ведущая последовательность окружена облаком мутантов, которые также обладают приспособленностью, достаточной для их сохранения в условиях эксперимента. При постоянных условиях ведущая последовательность и облако мутантов находятся в равновесии, и такой набор эволюционирующих макромолекул, для которого характерно стационарное распределение генотипов, получил название квази-вида. Это понятие эффективно используется для описания эволюции вирусов, хотя в данном случае равновесное состояние генотипов не является обязательным требованием к возможности применения такого понятия [79].
Идеи С. Спигельмана оказались исключительно продуктивными для последующего развития молекулярной биологии и легли в основу одного из ключевых подходов к получению новых белков и ферментов с использованием методов направленной эволюции макромолекул. Однако, в отличие от обсуждавшихся выше классических опытов, разнообразие последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, эволюционирующие in vitro в такой системе, возникает не спонтанно, а создается исследователем с помощью случайного мутагенеза перед каждым новым раундом отбора белков с требуемыми свойствами. Поэтому эксперименты по направленной эволюции белков начинаются с формирования комбинаторных клонотек случайных последовательностей, которые охватывают определенную часть исследуемого пространства последовательностей.
2.1. Комбинаторные клонотеки последовательностей нуклеотидов
Как следует из предшествующего изложения, для реализации концепции направленной эволюции белков требуется прежде всего иметь в распоряжении большой набор (выбор) макромолекул, среди которых можно было бы ожидать наличие белков с требуемыми свойствами. Если бы исходный пул макромолекул включал все возможные комбинации аминокислотных последовательностей, и желаемое свойство было бы присуще хотя бы одной из них, то получение нужного белка или фермента в требуе-
мых количествах было бы делом грамотного применения методов отбора и генно-инженерной техники. Следовательно, создание представительного пула (клонотеки) нуклеотидных и, как следствие, аминокислотных последовательностей является одной из первых задач белковой инженерии, основанной на применении принципов направленной эволюции. Однако, несмотря на значительный прогресс, на пути создания таких клонотек лежат значительные трудности.
