Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Получение нескольких мутаций в последовательных раундах ПЦР. При необходимости получения нескольких (до шести) сайт-специфических мутаций, удаленных друг от друга настолько, что их невозможно включить в один или два мутагени-зирующих праймера, можно использовать множественные раунды ПЦР в соответствии с недавно разработанной методикой [28, 29] (рис. 37). При таком подходе применяют один универсальный праймер и несколько мутагенизирующих, последовательности которых содержат требуемые мутации. В первом раунде ПЦР при введении в продукт ПЦР первой мутации с помощью мутантного праймера 1 в качестве матрицы используют ДНК, содержащую как мутагенизируемую последовательность, так и последовательность, комплементарную универсальному праймеру. Образовавшийся в итоге продукт ПЦР отделяют от матричной ДНК электрофорезом в полиакриламидном геле и, в свою очередь, применяют в качестве матрицы во втором раунде вместе с матричной ДНК, содержащей мутагенизируемую последовательность, но у которой отсутствует последовательность, комплементарная универсальному праймеру. Поскольку обе эти матрицы перекрываются, то в первом цикле второго раунда амплификации, происходящем в присутствии универсального праймера и встречного праймера, содержащего вторую мутацию, происходит достройка одной из перекрывающихся цепей с участием первого продукта ПЦР в качестве праймера с образованием двухцепочечной ДНК, содержащей в достроенной цепи первую мутацию. Далее образовавшийся гетеродуплекс используется в качестве матрицы в последующих циклах. В итоге продукт ПЦР после завершения второго раунда уже содержит две требуемых мутации. При повторении аналогичных раундов с использованием новых мутагенизирующих праймеров и универсального праймера происходит удлинение продукта ПЦР и введение в него новых требуемых мутации. Конечный продукт ПЦР, содержащий множественные мутации, может быть клонирован в соответствующем векторе стандартными методами, например, путем замещения исходного участка гена дикого типа.
Рис. 37. Схема введения нескольких сайт-специфических мутаций в последовательных раундах ПЦР [28]
S1 и S2 - боковые праймеры; Р1-Р6 - мутантные продукты ПЦР; ml-шб -мутагенизирующие праймеры; узкие черные полосы обозначают мутации; широкая черная полоса слева - место посадки праймера S1, штриховка справа -место посадки праймера S2
Матрица А (содержит сайт посадки праймера S1)
ml
1. ПЦР
2. Очистка продукта Р1 в геле (для удаления матрицы А)
Р1
ml
I
Матрица Б (не содержит сайт посадки праймера S1)
Р2
m2
ПЦР
ml
m2
I L
Р6
m3
5 циклов ПЦР с неочищенным продуктом Р2 и матрицей Б с последующими 25 циклами после добавления праймеров SI hS2
ml
m2 m3 m4 m5
m6
I 11 I I I
5 циклов ПЦР с неочищенным продуктом Р6 и матрицей Б с последующими 25 циклами после добавления праймеров SI hS2
S2
I 11 I I I
1.2.5. Мутагенез с использованием нонсенс-супрессоров
Генетический код, определенный в лабораториях Г. Кораны и М. Ниренберга в начале 1960-х гг., является основой для осуществления белковой инженерии. За немногими исключениями генетический код универсален для всех живых организмов, что позволяет планировать конкретные замены аминокислот в белках и проектировать целые белковые молекулы путем создания структурных частей соответствующих генов в виде конкретных последовательностей нуклеотидов. В то же время универсальность генетического кода оказывает отрицательное влияние на творческий потенциал белковых инженеров, так как не позволяет использовать аналоги аминокислот при проектировании новых белковых молекул и ограничивает их возможности 20-тью природными аминокислотными остатками. Такая ситуация стимулировала разработку методов, которые позволяют обходить вышеупомянутое затруднение. Группа методов, получивших название белковой инженерии, основанной на mPHK (tRNA-mediated protein engineering (TRAMPE)), позволяет расширить возможности использования генетического кода и обойти запреты, накладываемые системами трансляции на применение аналогов аминокислот при построении полипептидных цепей [30-32].
В ранних работах такого рода использовали химические модификации аминокислотных остатков непосредственно в составе аминоацилированных тРНК. В частности TPHKLys, аминоацили-рованную остатком Lys, после модификации агентом, осуществляющим поперечные сшивки после активации видимым светом, удалось превратить в Ы-8-(5-азидо-2-нитробензоил)-Ьу8-тРНКьУ8, которая направляла включение этого аналога в белки в бесклеточной системе трансляции. Синтезированные таким образом модифицированные белки далее использовали для исследования их участия в белок-белковых взаимодействиях путем образования поперечных сшивок с соседними белками [33].
При другом подходе, в одной из разновидностей направленного мутагенеза, получившей название сайт-специфического замещения неприродными аминокислотами (site-directed non-native amino acid replacement - SNAAR), использовали аминоацилиро-ванные аналоги тРНК, специфически распознающие бессмысленные кодоны UAG (amber), UAA (ochre) или UGA (opal) (т.е. супрессорные тРНК), для специфического включения соответствующих аналогов аминокислот в участки полипептидных цепей, определяемые нонсенс-кодонами. В этом случае стоп-кодоны вводили в кодирующие участки анализируемых генов стандарт-
