Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот - Лазуркина Ю.С.
Скачать (прямая ссылка):
1 Часто вместо / откладывается первая или вторая производная I по Н.
линии 2 э. В большинстве современных спектрометров ЭПР применяются другие схемы: спектрометры супергетеродинного типа и спектрометры с высокочастотной модуляцией и синхронным детектированием сигнала. В большинстве случаев записывается производная спектра поглощения, т. е. линии регистрируются в
координатах — — Н. Стандартные современные спектрометры dH
ЭПР могут регистрировать ~1012 свободных радикалов в сухом образце при полуширине линии 2 э. Переход на 8-миллиметровый диапазон и применение многократного прохождения с накоплением сигнала понижает эту предельную величину на порядок. Использование мощных клистронов и специальных конструкций кювет и резонаторов позволяет работать с водными образцами без значительного снижения чувствительности. Специальные приставки дают возможность варьировать температуру образца в пределах от гелиевых температур до 200— 300°, проводить исследования непосредственно при освещении образца или под электронным пучком.
в. Параметры спектров ЭПР
g - Ф а кт о р. Как было отмечено выше, для свободного парамагнитного атома g-фактор может принимать значения от 1 до 2 в зависимости от величины орбитального и спинового моментов количества движения атома. В молекулах, однако, а также в атомах и ионах в твердой и жидкой фазах орбитальный электронный момент парамагнитного центра жестко связан с окружением и не может свободно ориентироваться в магнитном поле. Благодаря этому «замораживанию» орбитального момента g-фактор большинства органических свободных радикалов, парамагнитных ионов в твердой и жидкой фазах оказывается весьма близким к чисто спиновому значению, т. е. к 2. Отклонения могут наблюдаться лишь при наличии низко лежащих возбужденных орбитальных уровней и больших констант спин-орбитального взаимодействия, что характерно для сравнительно тяжелых атомов. Точное определение g-фактора позволяет получить уникальную информацию о тонких деталях электронной структуры парамагнитного центра, особенно в случае монокристаллов, когда величина ^-фактора зависит от ориентации кристалла в магнитном поле. Измерение g-фактора органических свободных радикалов часто дает возможность локализовать положение неспаренного электрона. Так, например, если неспаренный электрон локализуется на легких атомах Н, С, N, О, то величина g-фактора превышает чисто спиновое значение (2,0023) не более, чем на несколько единиц в третьем знаке. В то же время при локализации свободной валентности на атоме серы g-фактор повышается до величины 2,024. Измерение
g'-фактора сигнала ЭПР окисного железа в гемине и метгемо-глобине (g-фактор оказался сильно смещенным и для монокристаллов при определенной их ориентации в магнитном поле достигал 6) позволило установить природу связей железа в этих структурах.
Ширина и форма линии. Важную информацию могут дать измерение ширины и анализ формы линии ЭПР. Согласно принципу неопределенности Гейзенберга,
AEAt~h. (13)
и ширина линии (А?) обратно пропорциональна времени жизни (At) возбужденного состояния. Время жизни возбужденного состояния парамагнитного центра определяется временем релаксации спинового магнитного момента, передающего свою энергию атомам и молекулам, окружающим парамагнитный центр. Это время релаксации принято называть спин-решеточным, или продольным, временем релаксации и обозначать Таким образом, чем больше Тх, тем уже должна быть линия. Как правило, в биохимических и биологических исследованиях проявляется почти чисто спиновой магнетизм, взаимодействие спин — решетка мало, Ту достаточно велико (~10~5 сек) и определяемая этим механизмом ширина линии не лимитирует экспериментально наблюдаемую ширину, которая обычно определяется другими факторами. Одним из таких факторов может быть спин-спиновое взаимодействие. Каждый неспаренный электрон находится не только во внешнем магнитном поле, но и в локальных полях, создаваемых магнитными моментами соседних неспаренных электронов. Это приводит к некоторому распределению эффективных магнитных полей и, следовательно, к уширению резонансной линии. Поскольку распределение полей носит случайный характер, форма линии в этом случае подчиняется уравнению Гаусса:
(Н - Я„;
I (Н) = /0ехр
2 <АЯ2>ср.
(14)
где /о — максимальная амплитуда сигнала в центре линии при Н = Н0, а <АЯ2>ср —параметр ширины линии. Естественно, ширина линии будет в этом случае возрастать при .уменьшении среднего расстояния между неспаренными электронами, т. е. при повышении концентрации парамагнитых центров в образце.
Любые процессы, приводящие к изменению во времени магнитных полей с частотой, достаточно большой для их эффективного усреднения, будут приводить к сужению линий ЭПР и изменению их формы. Такими процессами могут быть делока-лизация неспаренных электронов по молекуле или по кристаллу, их обменное взаимодействие, быстрое перемещение . парамагнитных частиц относительно друг друга. Форма линии при этом
