Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
В гл. 6 будут рассмотрены методы покрытия пластикЬв для культуры ткани поли-О-лизином, коллагеном или фибронекти-ном.
II. Влияние субстрата на клетки. Субстрат играет важную роль в поддержании нормальных клеточных функций. Изолированные гепатоциты выживают на пластике в течение только одной недели, тогда как на коллагене они могут сохранять жизнеспособность вплоть до месяца. На биоматриксе гепатоциты могут выживать в течение 6 мес и более. При культивировании клеток на пластике обнаруживается их тенденция к дедиффе-ренцировке, что проявляется в изменении морфологии. Так, эпителиальные клетки в этих условиях приобретают фибробла-стоподобную форму и начинают синтезировать белки, специфичные для фибробластов. Культивирование клеток на коллагене или биоматриксе поддерживает начальную дифференцировку и снижает необходимость добавления различных ростовых факторов или сыворотки.
3.2.4. Тесты для определения оптимальной среды
Сложные ростовые потребности большинства клеток млекопитающих создают определенные проблемы в оценке адекватности тест-систем, используемых для определения оптимальных ростовых сред. Более подробно эта проблема рассмотрена в обзоре Хэма [7]. Как правило, длительные (в течение нескольких суток) тесты на размножение клеток предпочтительнее, чем короткие тесты с включением 3Н-тимидина при оценке клеточной пролиферации, поскольку известен ряд артефактов, стимулирующих пролиферацию клеток [15]. Тем не менее метод оценки включения 3Н-тимидина часто используется для скрининга, но полученные результаты следует проверять с помощью теста на эффективность клонирования или просто путем подсчета клеток.
3.2.5. Среды для бессывороточных культур клеток или культур с низкой концентрацией сыворотки
В последние три десятилетия было разработано немало химически определенных сред, основанных на минимальной среде Игла (МЕМ). К их числу относятся МЕМ в модификации Дюльбекко (DME) и более сложные среды, такие как среда Ham F12, среды CMRL 1066, RPMI 1640, среда McCoy 5А и модифицированная Исковым среда Дюльбекко (IMDM). Все эти среды в настоящее время поставляются соответствущими фирмами, и состав этих сред можно узнать, воспользовавшись каталогами этих фирм. При составлении среды для бессыворо-точной культуры часто используют смесь DME и F12 в соотношении 1 : 1 (по объему), что позволяет объединить качественное богатство среды F12 (микроэлементы, повышенное содержание витаминов) с более высокой концентрацией питательных веществ среды DME. Для культивирования кроветворных клеток, включая гибридомы, весьма удобной представляется среда
IMDM, дополненная трансферрином, сывороточным альбумином и некоторыми липидами. Другие клетки крови, включая лейкозные клетки, успешно растут в среде RPMI 1640. Среда CMRL 1066 особенно богата нуклеозидами и некоторыми витаминами. Среды серии MCDB разработаны Хэмом с сотрудниками специально для культивирования нормальных клеток.
Наиболее часто используемые среды могут быть систематизированы следующим образом (2):
I. среды для постоянных линий с небольшими добавками
сыворотки или белков: MEM, DME, а-МЕМ, среда McCoy
5А RPMI 1640;
II. среды для постоянных линий с добавлением очищенных
белков или гормонов: F10, F12, DME;
III. среды для постоянных линий в монослое без добавления белков: CMRL 1066, MCDB411, DME;
IV. среды для клонального роста постоянных линий без добавления белков: F12, MCDB301, DME, IMDM;
V. среды для нетрансформированных клеток: DME, IMDM, MCDB 104, 105, 202, 401 и 501.
Исследования, проведенные с многими клетками млекопитающих, выявили ткане- и видоспецифичность потребности этих клеток в гормонах и питательных веществах. Хондроциты и фибробласты требуют добавления в основную среду липидов, тогда как эпителиальные клетки в этом не нуждаются. Хондроциты растут в присутствии ФРФ, тогда как кератиноциты и эпителиальные клетки бронхов, молочной железы и предстательной железы требуют добавления ФРЭ. Для кератиноцитов и эпителиальных клеток бронхов требуется также присутствие в среде этаноламина и т. д. [8].
Некоторые среды обычно можно использовать для культивирования клеток различных видов [2], например среду 199, DME, F12K и MCDB 202. Тем не менее для клеток индивидуальных видов предпочтительно использовать следующие среды:
I. для клеток обезьяны и человека: среда 199, среда
McCoy 5А, RPMI 1640, CMRL 1969, MCDB 104 и MCDB202;
II. для клеток крысы и кролика: среда МсСоу5А, F12 и
MCDB 104;
III. для нетрансформированных клеток мыши: DME,
CMRL1415, MCDB202 и MCDB401;
IV. для куриных клеток; среда 199, DME, F12K и MCDB 202.
3.2.6. Выбор гормонов и ростовых факторов
Как следует из приведенного обсуждения и из результатов анализа табл. 2.2, большинство бессывороточных сред включает в себя инсулин, трансферрин и селениты. Инсулин добавляется в среду в относительно высокой концентрации (1—10 мкг/мл),
