Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Этот метод может быть применен к пластинкам с определением поглощения в микрокюветах в обычном спектрофотометре, а также к 96-луночной пластине с регистрацией поглощения света на одной из доступных установок для просмотра пластинок (Flow, Gibco, Ilaon).
9.4.2. Определение включения аминокислот в клетки монослоя, растущего в лунках микротитровальных пластинок
Предлагаемый протокол описывает систему определения цитотоксичности лекарств при промежуточной продолжительности их воздействия. В основе лежит метод, впервые разработанный Фрешни с сотрудниками [29]. Условия инкубации н период восстановления могут варьировать в зависимости от задач опыта.
I. Добавьте по 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной микротитровальной пластинки. Плотность клеток зависит от их типа, скорости пролиферации и продолжительности опыта. Плотность монослоя в контрольных лунках не должна достигать насыщения к концу опыта, так как в этом случае скорость пролиферации снизится по сравнению с таковой в лунках с клетками, обработанными лекарством; кроме того, может произойти открепление контрольных клеток от субстрата. Плотность суспен-
зии при посеве клеток HeLa составляет 2-104 клеток/мл; клетки опухолей яичников человека рассеивают более высокой плотностью: 1—2-105 клеток/мл. При длительных опытах из внешних лунок может происходить испарение среды; поэтому внешние лунки следует заполнять средой без клеток. Краевые эффекты, обусловленные испарением, можно ослабить, если использовать пленки для заклеивания пластин (Mylar, Flow Laboratories). Некоторые лекарства могут быть летучими или образовывать летучие метаболиты (например, формамиды высвобождают формальдегид) ; в связи с этим неспецифическое цитотоксиче-ское действие может проявляться на клетки соседних лунок. При исследовании подобных лекарств такие пленки просто необходимы. Пластинки следует инкубировать во влажной атмосфере воздуха с 5% С02.
II. После прикрепления клеток и формирования делящегося монослоя (24 ч для клеточных линий, более продолжительное время при работе с первичными и вторичными культурами) смените среду и внесите в лунки соответствующие разведения лекарства. Для каждой концентрации следует использовать не менее трех лунок. Один ряд лунок должен служить контролем, содержащим только ростовую среду.
III. Инкубируйте клетки с лекарством в течение определенного времени. Если время превышает 24 ч, добавляйте свежие растворы препарата с 24-часовым интервалом. С другой стороны, могут быть использованы более короткие периоды экспозиции, например 1 ч, повторяющиеся в случае не-обходимости ежедневно.
IV. По окончании инкубации дважды аккуратно промойте монослой ФСБ. Добавьте в каждую лунку по 200 мкл свежей среды.
V. Инкубируйте клетки в течение определенного периода восстановления. Если последний превышает 3 сут, меняйте среду каждые 3 дня. Следите за тем, чтобы в контрольных лунках клетки не достигли полного монослоя.
VI. В конце восстановительного периода в каждую лунку добавьте по 20 мкл раствора 3Н-лейцина (Е-4,5-3Н-лейцин) (5—20 мкКи/мл) на 3 ч.
VII. Удалите изотоп и трижды промойте монослой ФСБ. Соблюдайте осторожность и не повредите монослой в ходе пипетирования. Для этого лучше всего наклонить чашку под углом 45° и ориентировать пипетку в угол между дном и боковой стенкой лунки.
VIII. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл фосфатного буфера и 100 мкл метанола, отсосите и добавьте по 100 мкл метанола. Фиксируйте клетки в течение 30 мин. Это предотвра^ тит открепление монослоя в ходе дальнейшей работы.
IX. Слейте метанол и высушите чашки током воздуха. Сухие чашки до начала последующих операций должны храниться при 4°С в течение не менее чем 48 ч.
X. Поместите чашки на лед и промойте монослой ледяной 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) (3 раза по
5 мин). При этом чашки можно просто переворачивать и 1—2 раза встряхивать.
XI. Отмойте монослои от ТХУ метанолом, высушите током воздуха и добавьте в каждую лунку по 100 мкл 1 н NaOH. Оставьте на ночь при комнатной температуре для солюбилизации белков.
XII. Перенесите 100 мкл NaOH из каждой лунки в мини-флаконы, помещенные в стеклянные сцинтилляционные флаконы.
XIII. Добавьте в каждый флакон по 2,4 мл сцинтилляционной жидкости (например, Fisofluor, Fisons Ltd.) и затем по 100 мкл 1,1 н НС1 для подкисления содержимого.
XIV. Закройте флаконы, перемешайте содержимое до гомогенности и просветления и просчитайте 5—10 мин в счетчике для ^-излучателей.
XV. Полученные результаты выразите в процентах от числа импульсов в контроле.
Некоторые клетки из биопсийного материала опухолей человека оказываются слабо адгезивными, но могут размножаться в суспензии. Предложенная методика полностью применима к таким клеткам при условии, что чашки будут отцентрифу-гированы при 1000 об/мин в течение 15 мин до удаления среды.
9.4.3. Измерение включения аминокислот в белки с помощью флюорографии
Описанная выше методика, использующая жидкостный сцин-тилляционный счетчик, оказывается трудоемкой и может быть источником проблем при работе с большим числом пласти^ нок, особенно при недостатке оборудования для (3-сцинтилля-ционного счета. Мини-флаконы могут терять сцинтилляционную жидкость через стенки после нескольких дней хранения, хотя такие потери снижаются в случае хранения препаратов перед счетом при 4°С. Во всяком случае, образцы должны быть просчитаны как можно скорее. Альтернативный метод, вполне пригодный для автоматизации, был предложен Фрешни с сотрудниками [43].
