Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
11.1. Большое среднеквадратичное отклонение
К числу возможных причин большого среднеквадратичного отклонения относятся:
I. ошибки в равномерности отбора клеточной суспензии, обусловленные, как правило, неаккуратным перемешиванием исходной суспензии в период отбора образцов. Это приводит к неравномерному распределению клеток между параллелями;
II. присутствие крупных клеточных агрегатов в исходной суспензии, приводящее к неравномерному распределению клеток между параллелями;
III. неспецифичность конечного результата при исследовании цитотоксичности (например, измерение несвязавшейся радиоактивности) (см. разд. 9.4.4).
11.2. Различия между опытами
При работе с биопсийным материалом опухолей человека нельзя, естественно, повторить опыт через несколько дней, чтобы проверить воспроизводимость результатов. Такая задача, однако, может быть решена при использовании клеточных линий. Сейчас уже твердо установлено, что линии клеток, обладающие определенным уровнем чувствительности, вдруг по невыясненным причинам дают «неодинаковые» ответы. К числу причин, приводящих к таким результатам относятся:
I. невозможность получать популяции клеток в идентичной фазе роста культуры (фаза экспоненциального роста, или ранняя стационарная фаза, или поздняя стационарная фаза);
II. порча исходных растворов лекарственных препаратов (см. разд. 5);
III. раствор лекарства с коротким временем полужизни следует использовать немедленно после разведения; это обеспечит постоянство действия его на клетки в каждом опыте;
IV. неспособность стандартизовать условия инкубации (см. разд. 9.2).
Система определения цитотоксичности должна воспроизводиться на клетках в культуре, прежде чем она будет применена к биопсийному материалу человека.
11.3. Стимуляция выше контрольного уровня
Стимуляция может быть истинной мерой клеточных событий, а может быть связана с техническими артефактами. К числу таких артефактов относятся:
I. неспедифическое связывание радиоактивности;
II. подавление метаболических реакций в контроле, зависящее от плотности монослоя и не проявляющееся в экспериментальных культурах, в которых часть клеток гибнет;
III. стимуляция включения клетками метаболического пред-
Рис. 8.9. Влияние размера колоний на кривые выживания клеток мышиной меланомы (линия CCL) в присутствии мелфалаиа (а) и биопсий меланомы человека в присутствии актиномицина D (б). Размер растущих колоний и их количество измеряли с помощью автоматизированной системы анализа изображения FASII. # » 60 мкм; О » 104 мкм; И ^ 124 мкм; ?>
>149 мкм. Показаны средние значения ± среднеквадратичная ошибка.
(Воспроизводится с разрешения издателей [58].)
шествецника антиметаболитами (например, стимуляция включения тимидина 5-фторурацилом и метотрексатом).
Результаты недавних исследований по определению эффективности клонирования показали [58], что плотность клеток при посеве влияет на размеры растущих колоний. При увеличении плотности посева число крупных колоний снижается. Проверили влияние этого эффекта на уровни чувствительности к лекарствам и показали, что, как и ожидалось, кривая зависимости опыта от концентрации сильно зависела от критерия размеров, выбираемого для регистрации колоний. При регистрации крупных колоний обнаружили стимуляцию выше контрольного уровня (рис. 8.9).
11.4. Сравнение цитотоксичности и противоопухолевой активности
При использовании результатов in vitro в качестве предварительного скрининга в поисках противоопухолевой активности следует делать различие между неспецифической цитотоксичностью и специфической противоопухолевой активностью. Следует помнить, что результаты опытов in vitro не могут служить критерием терапевтической эффективности лекарств. В табл. 8.5
Таблица 8.5. Предлагаемые критерии для дифференциации неспецифической цитотоксичности и противоопухолевой активности
Цитотоксичность
Проявляется в равной степени в популяциях делящихся и неделя-щихся клеток В разных популяциях опухолевых клеток ответы сходны
Отсутствие различий в ответах нормальных и опухолевых клеток Первичные биохимические повреждения связаны с нарушением энергетического метаболизма клеток или генерацией свободных радикалов
Противоопухолевая активность
Более эффективна в популяциях делящихся клеток
Гетерогенность ответов между разными популяциями опухолевых клеток
Опухолевые клетки более чувствительны, чем нормальные Первичные биохимические повреждения: (I) подавление репликации ДНК или транскрипции РНК. если препарат связывается с ДНК;. (II) подавление биосинтеза нуклеотидов
представлены главные критерии, которыми следует пользоваться для разделения этих двух эффектов лекарств, хотя существуют и исключения из этих правил.
12. Автоматизация
Автоматизация является совершенно необходимым условием широкого скрининга лекарств и опухолей. Однако ни одно из описанных выше исследований, за исключением, может быть, тех, которые подразумевают использование микротитровальных пластинок, недоступно для автоматизации. Получение количественных характеристик с помощью автоматических приборов в наибольшей степени реально для исследований с использованием радиоактивных изотопов, хотя это может потребовать высокого уровня технической оснащенности; эти требования значительно снижаются при использовании флюорографического метода, приведенного в разд. 9.4.3. Для автоматизированного подсчета колоний пригодны также различные устройства с распознаванием образов. Предложенный недавно метод регистрации электрического сопротивления клеточных культур обеспечивает щадящее
