Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
8. Сравнение систем исследования
Несмотря на различие методов, используемых для определения цитотоксичности и жизнеспособности, при их применении к биопсийному материалу опухолей человека, были получены одни и те же уровни корреляции между чувствительностью in vitro и ответами in vivo. Было проведено немало сравнительных анализов, при которых в качестве стандарта для сравнения выбирался процесс образования клонов. В табл. 8.3 обобщены результаты этих исследований. Оказалось, что при адекватном определении цитотоксичности результаты совпадают с данными теста на клоногенность.
9. Технические советы
9.1. Лекарственные препараты и их растворы
9.1.1. Источники ««карста
Фармацевтические препараты для внутривенного введения часто содержат различные добавки, которые сами по себе являются цитотоксичными. Такие препараты, следовательно, не-
пригодны для отбора образцов по весу, а если они и используются в качестве исходных растворов, то следует проводить определение цитотоксичности добаючных компонентов в используемых системах анализа. Эти проблемы легко обойти, если использовать чистые соединения, получаемые от производителей лекарств.
9.1.2. Хр«нми*
Рекомендуется хранить сухие соединения в эксикаторах над поглотителями влаги при температуре от —20° до —70°С. Это особенно важно для соединений, нестабильных в водных растворах. На практике часто используется приготовление концентрированных растворов лекарств, которые затем разливаются на порции и хранятся при —70°С. Хранение при более высоких температурах не рекомендуется, а часть лекарств (нитрозомо-чевины) оказывается нестабильной даже при таких условиях [46]. Некоторые лекарства могут связываться с обычно используемыми фильтрами из нитрата или ацетата целлюлозы, и стерилизация их растворов фильтрованием должна проводиться в контролируемых условиях, позволяющих определять связывание лекарства. Рекомендуется использовать максимально высокие концентрации лекарств и максимальные объемы раствора, чтобы насыщать фильтр первыми несколькими миллилитрами фильтрата, которые затем могут быть отброшены. С другой стороны, можно использовать неадсорбирующие фильтры, например фильтры из нейлона. Во всех случаях следует проверять фильтрат, чтобы убедиться, что активность не потеряна. Как показал опыт практической работы, подготовка нефармацевтических препаратов чистых лекарств в асептических условиях (т. е. взвешивание на стерильных подложках и растворение в стерильных контейнерах) обеспечивает отсутствие загрязнений даже в продолжительных экспериментах.
9.1.3. Рмтафикяри
I. Органические растворители. В табл. 8.4 представлены растворители, которые могут быть использованы для большинства химиотерапевтических противоопухолевых агентов. Для предотвращения цитотокснчности этанола его следует разводить в 1000 раз. ДМСО, как правило, не цитотоксичен в разведении 1 : 100, но некоторые первичные культуры опухолей человека чувствительны к этому соединению. Следовательно, при исследовании материала первичных культур всегда следует проводить контрольные проверки токсичности растворителя.
II. Компоненты среды. Некоторые лекарства прочно связываются с сывороточными белками (например, цисплатин), и присутствие сыворотки в культуральной среде может, следовательно, снизить действующую концентрацию препарата. Влияние сыворотки (в концентрации 5—20%) на чувствительность клеток к цисплатину зависит от продолжительности воздействия (рис. 8.6 А и Б). Так, при 3-часовом воздействии лекарства на
Таблица 8.4. Растворители для лекарств, используемых в химиотерапии рака
Растворимые в водных растворах
Адриамицин
Актиномиции D
Блеомицин
Митомицин С
Цнтозииарабинозид
5-Фторурацил
Метотрексат
Винбластин
Виикристин
ТиоТЭФ
Цисплатин
4-Г идропероксицикло-фосфамид
Прокарбазин
Нерастворимые
Хлорамбуцил
Мелфалаи
1,3-бис- (2-хлорэтил) -
1 -нитрозомочевина (BCNU)
(2-хлорэтил) -3-цикло-гексил-1 -нитрозомоче-вииа (CCNU)
Г ексаметилмеламии
6-Меркаптопурии
Используемые растворители
2% HCI: 98% этанола. Разводятся с 4,5 объемами пропан-1,2-дио-ла и 4,5 объемами солевого раствора или ДМСО 0,1 М НС1 или ДМСО
Этанол
Этаиол в сочетании с 1 объемом 5%-иого твииа 80 и 1 объемом фосфатного буфера ДМСО или гомогенизация в ДМСО с 9 объемами 5%-ного твина 80 в солевом растворе ДМСО
клетки они оказываются наиболее чувствительными при низкой концентрации сыворотки. Если продолжительность воздействия цисплатина увеличить до 48 ч, то клетки оказываются одинаково чувствительными при всех концентрациях сыворотки (Вил-сон, неопубликованные данные).
Компоненты некоторых сред могут защищать клетки от ци-тотоксического действия антиметаболитов. Так, например, ти-мидин и гипоксантин защищают клетки от действия метотрексата, а тимидин, кроме того, предотвращает действие 5-бром-дезоксиуридина и 5-фтордезоксиуридина. В работе [3] приведен внушительный список компонентов среды, защищающих клетки от антиметаболитов. Рассмотрение этого аспекта особенно важно при скрининге новых противоопухолевых агентов с возможной цитотоксической активностью.
