Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
9.1.4. Активация лекарстаенных препаратоа
Многие соединения, не являющиеся токсичными сами по себе, превращаются в цитотоксичные метаболиты благодаря системе оксидаз цитохрома Р-450, локализованной в печени. Наиболее широко известным химиотерапевтическим противоопухолевым агентом, требующим активации in vivo, является циклофосфамид. Разработан метод получения активных метаболитов из мочи пациентов, леченных циклофосфамидом; кроме
Цисплатин (мкг/мл)
Рис. 8.6. Влияние сыворотки на чувствительность клеток опухоли яичииков (линия OAW42) к цисплатину, измеряемую с использованием испытания иа микротитровальных пластинках (разд. 9.4.2). Экспоненциально растущие клетки обрабатывали цисплатином в течение 3 ч с 72-часовым восстановительным периодом (А) или в течение 48 ч с 24-часовым восстановительным периодом (Б). О—среда без сыворотки; 0 — 5% сыворотки; Д — 10% сыворотки; '?—20% сыворотки. Среднеквадратичное отклонение менее ±10%. (Э. Вилсон, неопубликованные данные.)
того, предложен метод активации лекарства in vitro с использованием микросомальной фракции S9 из печени крыс, получавших фенобарбитал. В последнее время получены чистые препараты фосфорамидного иприта и 4-гидропероксициклофосф-амида, и, хотя нельзя еще достоверно утверждать, который из метаболитов обладает противоопухолевой активностью in vivo, полученные экспериментальные данные позволяют думать, что таким метаболитом является скорее всего 4-гидропероксицикло-фосфамид [47].
В настоящее время разрабатываются другие методы активации in vitro с использованием культивируемых гепатоцитов крыс или биопсийного материала печени человека. Использование интактных клеток, в которых уровень кофакторов приближен к ситуации in vivo и оказывается достаточно высоким для поддержания определяемых этими кофакторами реакций, обеспечивает более близкое приближение к картине, наблюдаемой
in vivo, и несомненно может привести к получению результатов, отличающихся от полученных при использовании гомогенатов печени. В составе системы цитохрома Р-450 обнаружены видовые различия, использование гомогенатов печени человека поэтому сближает картины in vitro и in vivo. Важно помнить, однако, что существуют также и индивидуальные различия в метаболической активности этой системы. Эти аспекты более подробно рассмотрены в других работах [48, 49].
9.2. Инкубация с лекарствами
Наиболее распространенная процедура заключается в инкубации клеток с раствором лекарства сразу после ферментативной дезагрегации солидной ткани или сбора клеток путем трип-синизации монослоя. Имеются, однако, данные о том, что чувствительность клеток к лекарству изменяется в результате ферментативной обработки и сохраняется изменившейся в течение по крайней мере 12 ч после обработки ферментом [50]. В связи с этим следует предусмотреть в опыте прединкубационный период для свежевыделенных клеток, чтобы дать им восстановиться после действия трипсина. В течение всего периода инкубации необходимо поддерживать клетки при pH 7,4, поскольку изменения pH влияют на рост клеток, а щелочной pH особенно неблагоприятно сказывается на жизнеспособности клеток.
Сравнение статических и нестатических условий инкубации клеточной суспензии выявляет существенные различия в характере кривой зависимости эффекта препарата от его концентрации [51]. Поэтому клетки следует постоянно поддерживать в суспендированном состоянии для равномерного распределения лекарства. Если отношение площади поверхности к глубине среды в культуральном сосуде невелико, то инкубация в водяной бане на мешалке не обеспечивает поддержания клеток в суспензии, и в этом случае рекомендуется периодически встряхивать сосуд рукой (например, каждые 10 мин).
9. 3. Тесты, основанные на определении выживаемости и пролиферативной способности
9.3.1. Эффективнее?!) кяоиирввениа
Одним из наиболее широко распространенных тестов на цитотоксичность является определение способности одиночной клетки к образованию колонии. Это достигается простым разведением суспензии одиночных клеток, а выживание определяется подсчетом образуемых этими клетками колоний. В зависимости от времени удвоения изучаемых клеток и общей продолжитель-
ности опыта устанавливается нижний порог чувствительности, за который обычно принимается пять или шесть клеточных удвоений (32 или 64 клетки на колонию).
Некоторые лекарства оказывают влияние не только на пролиферацию, а также и на выживаемость как таковую (в некоторых случаях — только на выживаемость). Поэтому иногда необходимо анализировать не только число колоний, но и их размер. Так, подсчитывается количество клеток в колонии (трудоемкая операция, возможная только в случае небольших колоний), определяется диаметр колоний (способ неточный, так как клетки отличаются по размеру и по характеру расположения в колонии); кроме того, можно определять светопоглощение колоний, окрашенных 1%-ным кристаллвиолетом.
1. Клонирование в монослое. Клетки, способные к адгезии, высеваются на плоскую поверхность стекла или пластика для культуры ткани, где они растут и образуют колонии, которые могут быть окрашены и просчитаны. Если исследуется высокотоксичное лекарственное средство, обработку им лучше проводить до посева клеток. Для менее токсических веществ, требующих постоянного воздействия на клетки, возможно внесение его через 24—48 ч после посева клеток, и при этом его можно держать в культуре в течение всего периода клонального роста при условии стабильности этого вещества.
