Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
Буферные растворы готовят на дистиллированной воде, из которой при кипячении (в течение 30—45 мин) удален CO2, и хранят в сосудах с хлоркальциевой трубкой для предохранения от доступа CO2 из воздуха.
Использование сефадекса в гель-фильтрации. В ветеринарных лабораториях широко используют методы хроматографии. Для разделения и фракционирования метаболитов получил распространение метод фильтрования растворов через гель, названный «сефадекс» (Швеция) — гель-фильтрация. Сефадекс имеет вид мелких зерен, набухающих в воде. Например, для разделения полисахаридов с различной молекулярной массой рекомендуют следующие типы сефадекса.
Тип сефадекса
Молекулярная масса разделяемых полисахаридов
G—25, мелкий G—50, грубый
500-10 ООО 1000-50 ООО 5000-100 ООО 5000-200 000
100-5000
G-75 » G-100 »¦ G-200 »
37
У белковых веществ диапазоны молекулярных масс шире, чем у полисахаридов.
Для использования сефадекса служит хроматографическая колонка из боросиликатного стекла с рубашкой. Вначале сефадекс смешивают с водой, полученную смесь взмучивают, вливают в колонку и дают осесть. Затем в колонку добавляют концентрированный раствор исследуемого вещества так, чтобы не взмучивался верхний слой сефадекса. Равновесие устанавливается быстро, скорость вымывания значительно выше по сравнению с обычными ионитами. Фракции контролируют спектрофотометрически или по электропроводности.
Приготовление силикагеля и пластинок для метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Метод TCX имеет ряд преимуществ перед другими методами хроматографического анализа (колоночной хроматографии и хроматографии на бумаге): вещества разделяются быстро — от нескольких минут до 2—3 ч; можно разделять малые количества вещества (0,1—0,05 мкг), а также выделять их препаративно (от 100 до 500 мг). Основан метод на сорбции растворенных веществ адсорбентом; при движении растворителя с разделяемой смесью веществ по неподвижной фазе — адсорбенту разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в направлении движения растворителя. В качестве сорбентов применяют целлюлозу, Al2O3, кизельгур и др. Наибольшее применение получил си-ликагель — соединение общей формулы SiO2 • «H2O.
Адсорбционные свойства силикагеля могут быть существенно изменены добавлением кислот, оснований, солей. Силикагель, пропитанный 100%-ным раствором сульфата аммония, используют для разделения липидов и фосфолипидов, обработанный фосфатным буфером — для разделения аминокислот. Силикагель, им-прегнированный нитратом серебра, позволяет разделить отдельные молекулярные типы фосфолипидов в зависимости от степени ненасыщенности образующих их жирных кислот.
Для разделения липидов на отдельные фракции применяют марки силикагеля G, Н, DC, L, KCK гранулированный и др.
Подготовка силикагеля марки КСК. При отсутствии специально предназначенных для тонкослойной хроматографии силикагелей рекомендуют продажный гранулированный или кусковой силикагель марки KCK или ШСК. Для этого кусковой силикагель измельчают на шаровой мельнице и пропускают с водой через сито. Через 30 мин воду удаляют декантацией, а осадок промывают сначала горячей водой, затем горячим этанолом, опять водой и концентрированной соляной кислотой до приобретения фильтратом светло-желтой окраски. Отмывают водой до отрицательной реакции на ионы хлора (помутнение 1—0,1%-ного раствора серебра нитрата). На ионы железа проверяют с роданидом аммо-нидом (калия, натрия). Отмытый силикагель сушат при 120—130 °С
38
в течение 5—6 ч и просеивают через сита с размером ячеек 150—200 мкм. Хранят в банках с притертыми пробками.
Приготовление ТСХ-пластинок с закрепленным слоем сорбента. При отсутствии в лаборатории специального аппликатора для нанесения слоя сорбента на хроматографи-ческие пластинки последние можно изготовить следующим образом. Просеянный через сито с отверстиями диаметром 150—200 мкм си-ликагель тщательно перемешивают с 6 % (по массе) чистого медицинского гипса или 1 % растворимого крахмала и наносят смесь на поверхность матированных с помощью наждачного порошка обезжиренных стеклянных фотопластинок (13 х 18 см). Толщина слоя сорбента, образуемого на пластинке, обеспечивается при разравнивании его стеклянной трубкой (диаметром 1,5—2 см), на которую на расстоянии 12 см друг от друга наматывают по нескольку витков проволоки диаметром 0,5 мм. Такие кольца служат ограничителями размера наносимого слоя, а также гарантируют его постоянную толщину (0,5 мм). Пластинки с нанесенным слоем сорбента размещают на строго горизонтальной поверхности и опрыскивают из пульверизатора дистиллированной водой до полного насыщения слоя. После подсушивания на воздухе (избегать пыли) пластинки помещают в сушильный шкаф и активируют при 105—110 0C в течение 1 ч или при 140 °С в течение 0,5 ч. Приготовленные таким образом пластинки хранят в эксикаторах над поглотителем (кальция хлорид). При длительном хранении пластинок их активность следует периодически проверять.
Если пластинки готовят для экспресс-метода, сорбент можно наносить на пластинку в виде жидкой взвеси силикагеля с гипсом или крахмалом в воде с помощью пипетки. Более или менее однородные по свойствам пластинки получают при нанесении одинаковых объемов такой взвеси на каждую пластинку. Отклонения от рекомендованных марок силикагелей и режимов их обработки допускаются в исключительных случаях.
