Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 2.1. Эффективность разделения по методу ВЭЖХ на колонках,
заполненных частицами размером 10, 5 и 3 мкм (обращенная фаза Cie, элю-
ент : металон)(r)
dp, и, л, мкм 1, гг А Р, n/t с---1 t,
к=0 fe= 3 fe=0 *=з *=0 *=3
10 1 20 30 25 12 500 8330 8 12 8 17
10 5 000 3 330 3,2 7
3 1 500 1 000 1 2
5 1 15 16 25 16 670 15 625 32 16 15 17
10 6 670 6 250 12,8 7
3 2 000 1 875 3,8 2
3 2 11 10 25 22 730 25 000 180 45 50 8,5
10 9 090 10 000 71 3,5
3 2 730 3 000 21 1
а dp - размер частиц, и - линейная скорость, h - высота,
эквивалентная теоретической тарелке, ( - длина колонки, п - число
теоретических тарелок, \Р - перепад давления, till - скорость разделения,
< -длительность разделения.
Такое же число тарелок можно получить на колонке длиной 10 см с
частицами размером 3 мкм. Однако длительность разделения при этом для &=3
снижается с 17 до 3,5 мин. Таким образом, основное достоинство колонок,
заполненных частицами малого диаметра, - высокая скорость разделения. Для
частиц диаметром 3 мкм эта величина составляет порядка 50 тарелок/с.
Табл. 2.1 показывает также, что для короткой колонки, заполненной мелкими
частицами (3 мкм), значение h уменьшается с увеличением k из-за
особенностей хроматографического оборудования (объемов дозировочной
петли, коммуникаций, ячейки детектора, мертвого времени детектора н
самописца).
Для большинства задач, выполняемых методом ВЭЖХ, достаточно 3000
теоретических тарелок. В приведенном примере это значение было достигнуто
для k = 3 на 10-см колонке, заполненной частицами диаметром 10 мкм.
Длительность разделения при этом составляет 7 мин, необходимый перепад
давления равен 0,32 МПа. Такое число теоретических тарелок можно получить
на 5-см колонке при диаметре частиц 5 мкм (время разделения 4 мин,
перепад давления 0,7 МПа). Для частиц диаметром 3 мкм длина колонки может
равняться всего 3 см (1 мин, 2,1 МПа), Однако ширина пика прн 6 = 3
составляет всего 4,4 с, поэтому для обнаружения необходимы безынерционные
детектор и самописец [17]. С уменьшением ширины пика его высота
увеличивается, соответственно увеличивается и чувствительность
обнаружения. Поэтому анализ микроколичеств
Хроматографическая колонка 27
целесообразно проводить на очень коротких колонках, заполненных
частицами малого диаметра, обеспечивающих необходимое для разделения
число тарелок. Следует отметить, что использование длинных колонок,
заполненных очень мелкими частицами, приводит к нежелательным градиентам
вязкости и температуры внутри колонки, влияющим на форму пиков и время
удерживания [18].
Сравнение достоинств и недостатков частиц правильной сферической и
неправильной форм [6, 19-21] показало, что форма частиц не оказывает
существенного влияния на эффективность колонки, между тем стоимость
сфер.ических частиц существенно выше [20, 21]. Однако проницаемость
колонок, заполненных сферическими частицами, несколько лучше. Если
разделение проводят при незначительной высоте, эквивалентной
теоретической тарелке, и небольших скоростях [5], то для описания
процесса достаточно одного уравнения (одной кривой) для разных элюентов и
частиц разного диаметра [22-24]. Это же уравнение позволяет сделать
выводы, касающиеся оптимального размера частиц, минимальной объемной
скорости и эффективности колонки, которые обсуждались выше.
2.1.3. Оценка эффективности колонки
Итак, как следует из сказанного выше, чтобы разделение прошло успешно,
необходима "хорошая" колонка. Эффективность колонки зависит от диаметра
частиц, распределения частиц по размеру и степени однородности ее
заполнения. Заполнение колонок в подавляющем большинстве случаев проводят
суспензионным методом. Самостоятельное заполнение колонок (и получение
воспроизводимых результатов) требует опыта, навыков и соответствующего
оборудования. В настоящее время большинство типов материалов,
используемых для заполнения колонок, характеризуются достаточно узким
распределением частиц по диаметрам. Различные методы заполнения колонок
рассмотрены в работах [1, 2, 25].
Ниже будет описан простой метод определения сопротивления и
эффективности колонки на основе данных о диаметре частиц (в методе
применяют легко измеряемые параметры [2, 7]). Одновременно с оценкой
колонки проверяют и другое хроматографическое оборудование. Испытания
следует проводить с легкодоступными соединениями и чистыми
растворителями. Обычно для оценки колонок с обращенной фазой или
силикагелем выбирают метанол или дихлорметан соответственно. Коэффициенты
емкости соединений, выбираемых для оценочных испытаний, должны лежать в
интервале от нуля (инертные соединения) до трех. Для обращенно-фазовой
