Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
метод биохимии. В этой книге мы после краткого изложения основ теории и
принципов инструментального оснащения ВЭЖХ подробно рассмотрим применение
ВЭЖХ для анализа и разделения различных классов и групп соединений,
представляющих интерес для биохимика.
Мюнхен, Вальдброн и Тюбинген, А. Хеншен
октябрь 1984 К.-П. Хупе
Ф. Лотшпайх
В. Вёлтер
1
Основы теории и основные понятия хроматографии
К. П. Хупе (К.-Р. Нире)
1.1. Введение
Данная глава представляет собой краткое введение в теорию
хроматографических процессов. В ней объяснены понятия и определения,
используемые в последующих главах, дано количественное описание процессов
разделения, рассмотрены термодинамические и кинетические механизмы
хроматографии. Свойства различных подвижных и неподвижных фаз обсуждены в
гл. 2.
Для более глубокого изучения теории жидкостной хроматографии можно
рекомендовать следующие учебники [1-3].
Номенклатура и обозначения, принятые в данной книге, соответствуют
рекомендациям Американского общества испытания материалов (ASTM) [4],
подробно прокомментированным Эттре [5].
1.2. Удерживание
Хроматография - это метод разделения веществ. После разделения смеси на
хроматографической колонке на отдельные компоненты при помощи детекторов
проводят их качественную и (или) количественную идентификацию.
Отрабатывая методику хроматографического разделения, следует добиваться
выполнения двух условий - разделение должно быть достаточно хорошим при
минимально допустимых затратах времени. На практике необходимо учитывать
и третье условие-имеется в виду ограничение на предельное давление, при
котором проводят разделение, накладываемое техническими возможностями
насосов и другого хроматографического оборудования.
Разделение смеси на отдельные компоненты происходит в результате их
различного физического и химического взаимодействия с подвижной
(элюентом) и неподвижной (насадкой) фазами.
Время удерживания и удерживаемый объем связаны следующей
зависимостью:
F=VR!tB = VM/tM (1)
где F - объемная скорость, мл/мин.
Основы теории и основные понятия хроматографии
Рис. 1.1. Определение хроматографического времени удерживания.
Скорость перемещения по колонке фронта подвижной фазы, или линейная
скорость и, определяется следующим отношением:
u = F/Ac=lltM (2)
где Ас-площадь сечения колонки, а I - ее длина.
На рис. 1.1 приведены важнейшие параметры, характеризующие разделение,
а именно: tR - время удерживания (время между нанесением пробы на колонку
и выходом из нее какого-либо конкретного компонента разделяемой смеси),
VR - объем удерживания (объем подвижной фазы, прошедший через колонку за
время tR), tM - мертвое время колонки (время удерживания несорбирующегося
вещества), VM - мертвый объем колонки (объем подвижной фазы в колонке).
По мере перемещения по хроматографической колонке компоненты
разделяемой смеси постоянно флуктуируют из подвижной фазы в неподвижную и
обратно. Если они находятся в подвижной фазе, то перемещаются вместе с
нею со скоростью и, если же компоненты сорбируются неподвижной фазой, то
их перемещение прерывается. Кажущаяся средняя скорость перемещения
соединений по колонке определяется выражением
= (3)
Время удерживания (tR) складывается из времени пребывания молекул в
подвижной tM и на неподвижной фазах tR':
tR - tM~\-tn (4)
Отношение tR'jtM - это важная термодинамическая характеристика,
описывающая взаимодействие разделяемых компонентов
12 Глава I
и хроматографической системы (под хроматографической системой
подразумевают в данном случае подвижную и неподвижную
фазы). В равновесных условиях tR'ftM отражает относи-
тельное количество молекул разделяемого вещества, находящихся в подвижной
и неподвижной фазах. Поэтому отношение tn'lht получило название отношения
распределения масс, но, к сожалению, более распространено другое его
название - коэффициент емкости (коэффициент извлечения) k:
k = tft jtbl = (tR-/дг) /^Af = ( Vr-Vm) IVm
(5)
После преобразования уравнения (5) получаем выражение, связывающее
коэффициент емкости и время удерживания:
^л=^л/(^+1)
(6)
Время удерживания данного вещества при заданной объемной скорости может
использоваться для его идентификации.
Коэффициент емкости связан с константой распределения К данного
вещества через "фазовое отношение". Константа распределения К - это
отношение концентрации вещества с в неподвижной 5 и подвижной М фазах:
