Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
K~CsIcm
(7)
Фазовое отношение определяют как отношение объема подвижной фазы в
колонке Vm к объему неподвижной фазы Vs:
$ = VmIVs
(8)
В адсорбционной хроматографии Vs заменяют на площадь поверхности
неподвижной фазы, и, следовательно,
(9)
Коэффициент емкости k характеризует отношение между линейной скоростью и
подвижной фазы и средней скоростью перемещения разделяемого вещества их.
Из уравнений (2), (3) и (6)
находим
Их/И- 1/(Л+1)
(10)
Значение k может изменяться от нуля до бесконечности. Если А = 0, то эго
означает, что их~и, т. е. компоненты разделяемой смеси не удерживаются в
колонке. Если к=оо, то их = 0, а это означает, что компоненты необратимо
абсорбируются неподвижной фазой и в выбранных условиях не элюируются.
Отношение коэффициентов емкости компонентов смеси 1 и 2 называют
коэффициентом разделения а, или селективностью колонки:
a=kz/ki {h>ki)
(И)
Основы теории и основные понятия хроматографии 13
1.3. Разделение
Согласно рис. 1.1, разделение хроматографических пиков тем лучше, чем
больше разность между временами удерживания двух следующих друг за другом
веществ (tR2-/hi). С учетом уравнения (6) имеем
tfl2-^Я1 = ^м(&2-k\) (12)
Подставляя значение tM из уравнения (2), получаем
^R2--^Я1=(1/ы)(&2--k\)l (13)
Из этого уравнения следует, что разность между временами удерживания
компонентов увеличивается пропорционально росту разности между их
коэффициентами емкости и для данной объемной скорости пропорционально
увеличению длины колонки /.
1.4. Дисперсия
1.4.1. Процесс размывания зоны
На описанный выше процесс разделения компонентов в хроматографической
колонке отрицательно влияет размывание зон отдельных компонентов,
обусловленное диффузионными процессами. Согласно рис. 1.2, эффект
размывания характеризуется шириной пика у основания т)ъ, которую
определяют как отрезок, отсекаемый на нулевой линии двумя касательными,
проведенными к пику, или шириной пика на высоте точек перегиба W{. Если
хроматографический пик описывается кривой Гаусса, то
wb = 2wi = 4a (14)
где а - величина стандартного отклонения, выражаемая в единицах длины,
времени или объема [6] (кривая Гаусса в теории вероятностей описывает
отклонения от среднего значения некоей величины, подверженной
флуктуациям, в частности разброс ошибок измерения). Необходимо отметить,
что графическое определение стандартного отклонения на хроматограмме
возможно в том случае, если форма пиков соответствует истинно гауссовому
распределению. На практике в большинстве случаев это условие не
выполняется.
Ширина пика, как показывают и теория, и практика, увеличивается
пропорционально корню квадратному из длины пути, пройденного веществом в
колонке. Если какое-либо вещество полностью элюировалось из колонки,
длина его пути равна длине колонки, т. е.
а"У/; а2"/ где о2- дисперсия пика.
(15)
14
Глава 1
+R2_tRl
X
Рис. 1.2. Параметры, характеризующие разделение и размывание.
Время
Вводя в соотношение (15) коэффициент пропорциональности h, получаем
следующее выражение:
Уравнения (13) и (16) отражают два основных хроматографических
процесса - разделение и дисперсию (размывание) пиков. Оба эффекта
усиливаются с увеличением длины колонки. Важнейшую роль в выявлении
механизма хроматографических процессов, их описании и оптимизации имеет
определение значений коэффициентов пропорциональности соответствующих
зависимостей (&2-&i) и h.
Параметр h в уравнении (16) отражает эффекты, приводящие к размыванию
узкой зоны вещества при его перемещении вместе с подвижной фазой вдоль
колонки. В результате усиливающихся дисперсии и разбавления элюируемое
вещество выходит из колонки в виде более разбавленного раствора, чем
раствор, подаваемый на колонку.
Мерой размывания полосы вещества в колонке является "высота,
эквивалентная теоретической тарелке" (ВЭТТ). Этот термин, по-видимому, не
совсем удачен и часто смущает студентов, так как у него очень мало общего
с разделительными "тарелками" в дистилляционных колонках. Более приемлем
в данном случае, по-видимому, термин "коэффициент дисперсии".
Однако в теории хроматографии понятие "теоретическая тарелка" играет
очень важную роль. Предполагается, что математический эквивалент
хроматографической колонки представляет собой колонку с тарелками, на
каждой из которых достигается равновесное распределение разделяемого
вещества между тарелкой и подвижной фазой. Число теоретических тарелок п
