Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
пиранозной и фуранозной формах. Наличие равновесных форм углеводов
приводит к уширению хроматографических пиков, особенно при относительно
низкой температуре.
Разделение свободных углеводов может протекать по механизму
адсорбционной, распределительной, ионообменной или гель-проникающей
хроматографии. Адсорбционная хроматография в настоящее время утратила
свое первоначальное значение, тогда как остальные три принципа положены в
основу наиболее важных современных методик анализа углеводов.
8.4.1. Жидко-жидкостная хроматография на ионообменных смолах
Этот метод был впервые предложен Самуэльсоном и др. [6, 17, 18]. Для
разделения применяются ионообменные смолы на основе полистирола, сшитого
дивинилбензолом, - анионообменни-ки в S042-- или С1~-форме и
катионообменники в ОН--, Са2+-или Ва2+-формах. Элюентом служит водный
примерно 90%-ный раствор этанола. Обнаружение осуществляется при помощи
реакционного детектора с использованием орсин-сернокислотного реагента.
438
Глава 8
Рис. 8.4. Разделение стандартной смеси (а) и гидролизата гликопротеииа
(б) из слизистой оболочки желудка.
Колонка: 300X0,4 см; неподвижная фаза: сильнокислая ионооб-менная смола
дурум, DC-44, Li-форма, 8±1 мкм, Пало-Альто, США; температура 65 °С;
элюент: 89%-ный этанол; объемная скорость: 0,3 мл/мни; обнаружение: й
внде производного бицинхоннната (послеколоноч-ное модифицирование).
t, МИН t, МИН
Быстрое разделение углеводов было проведено при повышенных
температурах на смоле техникон типа S (250 мкм) в сульфатной форме при
элюировании 89%-ным водным этанолом [19]. В указанных условиях за 3 ч
было разделено 8 углеводов. Для обнаружения была использована реакция с
тетразолиевым синим.
Селективность этого способа разделения зависит от концентрации спирта
в элюенте, вида противоиона, а также от степени сшивки смолы. Ионы
щелочных, щелочноземельных и некоторых переходных металлов образуют
комплексы с полигидроксиль-ными соединениями и потенциальными
ендиолятами. Например, аллозу, альтрозу и маннозу чрезвычайно трудно
разделить на ионообменной смоле в сульфатной форме, однако на смоле в
литиевой форме достигается прекрасное разделение. Эту же не-
ы
4
t, мин
Рис. 8.5. Разделение гидролизата гликопротеииа слизистой оболочки желудка
(тот же препарат, что и на рис. 8.4).
Колонка: 20X0,4 см; неподвижная фаза: нуклеоснл 5SA
скорость: °'8 мл/мин; элюент: ацетонит-рил/н20 (88 :
12); обнаружение: при 195 нм.
Углеводы 439
подвижную фазу можно использовать для разделения олигосахаридов, а также
нейтральных сахаров, например маннозы, галактозы и фукозы, входящих
обычно в состав гликопротеинов. Время разделения в последнем случае
составляет 10-20 мин (рис. 8.4). Глюкозу и маннозу с помощью данного
метода разделить не удается.
Замена полистирол-дивинилбензольной матрицы на силикагель положительно
влияет на эффективность разделения, по крайней мере на ионообменниках в
литиевой форме [23], что иллюстрирует рис. 8.5.
8.4.2. Жидко-жидкостная хроматография на силикагеле с нанесенной in situ
или привитой полярной фазой
Проводить разделение моно- и олигосахаридов на немодифици-рованном
силикагеле не рекомендуется, поскольку даже при небольшом содержании воды
в элюенте, например при элюировании смесью ацетонитрил/вода, все углеводы
элюируются очень быстро и, как правило, у полученных пиков наблюдаются
большие хвосты. Некоторые авторы [15, 21], проводя разделение указанных
соединений, добавляли в элюент полиамины [15, 21]. После пропитки
силикагеля таким элюентом in situ неподвижная фаза приобретает высокую
полярность и слабоосновные свойства. В силу более высокой кислотности
силаноль-ные гидроксильные группы образуют с полиаминами более прочные
связи, чем гидроксильные группы углеводов. Модифицированная полиаминами
неподвижная фаза по своим свойствам напоминает аминофазу с химически
привитыми аминогруппами. Влияние полиамина (пиперазина) на разделение
некоторых моносахаридов демонстрирует рис. 8.6. На этом же рисунке
приведена хроматограмма, полученная на носителе с химически привитой
аминофазой (как и на примере, показанном на рис.
8.4, разделению подвергался гидролизат гликопротеина, выделенного нз
слизистой оболочки желудка).
В работе [24] описаны химически привитые аминофазы, позволяющие
использовать для разделения углеводов элюенты, содержащие до 40% воды.
Если исходить из получаемой последовательности элюирования, то можно
предположить, что разделение происходит главным образом по механизму
жидко-жидкостной распределительной хроматографии.
Для гомологических рядов углеводов, характеризующихся систематическим
увеличением содержания гидроксильных групп, наблюдается увеличение
коэффициента емкости. Первыми элюируются дезоксисахара, затем кетозы,
альдозы и последними - полиолы. Эффективного разделения членов
гомологических ря-
440 Глава 8
Фукоза
Манноза
" * 2 С,МИН
